王斌 梁偉龍 林欽賢

【摘 要】 目的：建立不同產(chǎn)地牡丹皮藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。方法：以17個(gè)產(chǎn)地的牡丹皮藥材為研究對(duì)象，測(cè)定其沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷、浸出物、總灰分的含量，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)分析法，建立牡丹皮藥材質(zhì)量的灰色關(guān)聯(lián)度評(píng)價(jià)模型。結(jié)果：17個(gè)產(chǎn)地牡丹皮藥材的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.314～0.597之間，山西運(yùn)城、安徽銅陵、安徽南陵產(chǎn)地牡丹皮樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度排名靠前，藥材質(zhì)量較優(yōu)，湖北恩施、重慶墊江、安徽亳州、山東菏澤產(chǎn)地牡丹皮樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度排名靠后，藥材質(zhì)量較差。結(jié)論：研究結(jié)果可為牡丹皮資源的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 牡丹皮;不同產(chǎn)地;灰色關(guān)聯(lián)分析法;相對(duì)關(guān)聯(lián)度;質(zhì)量評(píng)價(jià)

Abstract：Objective To establish the quality evaluation method of cortex moutan from different producing areas.Methods Seventeen samples of cortex moutan from differenct producing areas were collected，the contents of gallic acid，catechin，oxidation paeoniflorin，paeoniflorin，benzoic acid，paeonol，benzoyl-paeoniflorin，extract and total ash of cortex moutan were determined.The grey correlation degree model for evaluating the quality of cortex moutan was established by grey correlation analysis.Result The relative correlation degrees of all evaluation samples were in the range of 0.314～0.597.The samples of cortex moutan produced in Yuncheng City of Shanxi Province，Tongling City of Anhui Province and Nanling City of Anhui Province ranked the top few in the relative correlation degrees，which had better quality.The samples of cortex moutan from Enshi City of Hubei Province，Dianjiang County of Chongqing，Bozhou City of Anhui Province and Heze City of Shandong Province ranked the bottom few in the relative correlation degrees，indicating that the samples produced in these areas had poor quality.Conclusion The results of this study can provide a reference basis for the exploitation and utilization of this resources.

Keywords：Cortex Moutan;Different Producing Areas;Grey Correlation Degree Method;Relative Correlation Degrees;Quality Evaluation

牡丹皮為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，味苦、辛，微寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、活血化瘀的功效[1]，主產(chǎn)于安徽、山東、河南、湖南、湖北、四川、重慶等地。牡丹皮中主含酚及其苷類、單萜及其苷類兩大類，亦含有機(jī)酸、三萜、黃酮、香豆素、揮發(fā)油、多糖及微量元素等多種成分[2-7]。

灰色關(guān)聯(lián)分析法為灰色系統(tǒng)理論的重要組成部分，主要針對(duì)信息不完全、機(jī)制不明確的灰色系統(tǒng)，根據(jù)數(shù)據(jù)序列曲線的相似程度分析因子間的量化和序化，實(shí)現(xiàn)對(duì)系統(tǒng)的預(yù)測(cè)、決策等功能[8-11]，目前已在許多中藥研究中應(yīng)用，如基于灰色關(guān)聯(lián)分析方法評(píng)價(jià)甘肅產(chǎn)紅芪質(zhì)量[12]、牡丹皮不同采收期質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究[13]，采用灰色關(guān)聯(lián)度法綜合評(píng)價(jià)不同采收期的牡丹皮藥材質(zhì)量，取得了許多科技成果。為了客觀、全面地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地牡丹皮藥材的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)以17個(gè)不同產(chǎn)地牡丹皮藥材為研究對(duì)象，按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版方法測(cè)定浸出物和總灰分，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定其沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷含量，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)分析法，建立灰色關(guān)聯(lián)度模型，為牡丹皮藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）、MX5型、XS-204型電子天平（Mettler Toledo）、DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SXL-1208型程控式箱式電爐（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

1.2 材料 沒食子酸（110831-201605，純度90.8%）、兒茶素（110877-201604，純度99.2%）、芍藥苷（110736-201539，純度96.4%）、丹皮酚（110708-201407，純度99.9%）和苯甲酸（100419-200301）購自中國(guó)食品藥品檢定研究院;氧化芍藥苷（MUST-16021505，純度99.93%）和苯甲酰芍藥苷（MUST-16061803，純度99.28%）購自成都曼斯特有限公司;HPLC級(jí)甲醇（Merck）和磷酸（阿拉丁）;其余試劑為分析純，超純水。牡丹皮藥材于2017年先后于安徽、山東、湖南、湖北、重慶、四川等牡丹皮藥材主產(chǎn)區(qū)收集，經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司康志英高級(jí)工程師鑒定為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，樣品來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸出物 按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部醇溶性浸出物測(cè)定法（通則2201）項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑。

2.2 總灰分 按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部總灰分測(cè)定法（通則2302）進(jìn)行測(cè)定。

2.3 多成分含量測(cè)定[14]

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷適量，精密稱定，加50%甲醇水分別制成每1mL含沒食子酸0.5μg、0.5μg、15μg、20μg、20μg、50μg、50μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 取牡丹皮藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，加熱回流提取1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密移取續(xù)濾液1mL，置10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，過0.45μm的濾膜，即得。

2.3.3 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250mm × 4.6mm，5μm）;檢測(cè)器為DAD檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，258nm（氧化芍藥苷）;流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15min，10%A→32%A;15～25min，32%A→48%A;25～40min，48%A→58%A）;流速為1mL·min-1;進(jìn)樣量：10μL;柱溫：30℃。在此條件下，取對(duì)照品溶液、供試品溶液分別進(jìn)樣10μL分析，HPLC色譜圖如圖1所示。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1、3、5、7、10、15μL，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下分析，以對(duì)照品的量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄7個(gè)對(duì)照品峰面積，結(jié)果顯示7個(gè)成分的峰面積RSD均小于1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下分別于0、3、6、9、12、18、24h進(jìn)樣分析，記錄7個(gè)成分的峰面積，結(jié)果顯示7個(gè)成分峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定同一樣品粉末6份，按“2.3.2”方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示7個(gè)成分的含量RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的牡丹皮粉末約0.25 g，共6份，加入與7個(gè)成分等量的對(duì)照品，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.4 各指標(biāo)成分含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地牡丹皮藥材樣品，分別按“2.1”、“2.2”、“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定浸出物、總灰分、以及沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷的含量，結(jié)果見表4。

2.5 灰色關(guān)聯(lián)度分析法的建立

2.5.1 參考序列選擇 設(shè)有n個(gè)研究樣品，每個(gè)樣品有m項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，組成評(píng)價(jià)單元序列，記為{Xik}（i=1，2，3……n;k=1，2，3……m;本研究中n=17，m=9）。為了統(tǒng)一藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用將低指標(biāo)高優(yōu)化的方法，本試驗(yàn)將總灰分進(jìn)行取倒數(shù)轉(zhuǎn)換，與沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷和浸出物指標(biāo)共同組成指標(biāo)矩陣。藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)統(tǒng)一后，將最優(yōu)參考序列的各指標(biāo)對(duì)應(yīng)n個(gè)不同產(chǎn)地樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最大值，記為{Xsk}=max（1≤i≤n）{Xik}，最差參考序列的各指標(biāo)對(duì)應(yīng)n個(gè)不同產(chǎn)地樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最小值，記為{Xtk}=min（1≤i≤n）{Xik}。

2.5.2 原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理 以平均值變換最為常用，見公式（1）。

2.5.4 關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 相對(duì)于最優(yōu)參考序列、最差參考序列的關(guān)聯(lián)度分別按公式（4）、（5）計(jì)算得到。

2.5.5 相對(duì)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 最佳評(píng)價(jià)單元是評(píng)價(jià)單元與最優(yōu)參考序列關(guān)聯(lián)程度最大，同時(shí)與最差參考序列的關(guān)聯(lián)程度最小值，所以將評(píng)價(jià)單元序列同時(shí)相對(duì)于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的相對(duì)ri關(guān)聯(lián)度定義為公式（6）。

2.5.6 樣品數(shù)據(jù)集的建立 測(cè)定不同產(chǎn)地牡丹皮藥材中9種成分的含量，建立牡丹皮藥材質(zhì)量灰色模式識(shí)別數(shù)據(jù)集，見表4。

2.5.7 數(shù)據(jù)規(guī)格化處理 將原始測(cè)定數(shù)值按公式（1）進(jìn)行數(shù)據(jù)規(guī)格化處理，結(jié)果見表5。

2.5.8 關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算 分別按照公式（2）、（3）計(jì)算各評(píng)價(jià)單元相對(duì)于最優(yōu)、最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)ζik（s）、ζik（t），結(jié)果見表6、表7。

2.5.9 關(guān)聯(lián)度與相對(duì)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 分別按公式（4）、（5）計(jì)算各評(píng)價(jià)單元相對(duì)于最優(yōu)、最差參考序列的關(guān)聯(lián)度ri（s）、ri（t），按公式（6）計(jì)算出17個(gè)不同產(chǎn)地牡丹皮藥材樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度ri，并進(jìn)行質(zhì)量排序，結(jié)果見表8。

2.5.10 藥材質(zhì)量評(píng)價(jià) 相對(duì)關(guān)聯(lián)度ri越大，表明該產(chǎn)地牡丹皮藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)越高，ri排序結(jié)果可作為藥材質(zhì)量高低評(píng)價(jià)的依據(jù)。由表8可見，17個(gè)產(chǎn)地牡丹皮藥材樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.314～0.597之間，其中6個(gè)產(chǎn)地樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度>0.50，5個(gè)產(chǎn)地樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.45～0.50之間，6個(gè)產(chǎn)地樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度<0.45，表明不同產(chǎn)地牡丹皮藥材質(zhì)量存在差異。山西運(yùn)城絳縣（S07）、山西運(yùn)城聞喜（S06）、安徽銅陵（S01）、安徽南陵（S09）和陜西商洛（S15）的相對(duì)關(guān)聯(lián)度分別為0.597、0.583、0.546、0.537、0.532，排名前5位，藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)優(yōu)。湖北恩施利川（S10）、重慶墊江（S17）、亳州十九里（S03）、亳州五馬（S04）、亳州華佗（S02）和山東菏澤（S05）的相對(duì)關(guān)聯(lián)度分別為0.414、0.401、0.392、0.381、0.376、0.314，排名后6位，藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)較差。

3 討論

3.1 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 在建立牡丹皮藥材多成分含量測(cè)定的過程中，曾對(duì)流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)選，選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%醋酸水溶液等多種流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，甲醇-0.1%磷酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)基線平穩(wěn)，干擾較小，各指標(biāo)成分峰分離度良好，故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液為牡丹皮的流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.2 提取方式的選擇 本試驗(yàn)考察超聲提取、回流提取的提取方式，結(jié)果顯示，回流提取的芍藥苷和丹皮酚峰面積均高于超聲提取，且重復(fù)性結(jié)果優(yōu)于超聲提取。比較回流提取0.5h、1h、1.5h，回流1h和1.5h含量相近，而芍藥苷峰面積略高于0.5h，綜合考慮，確定牡丹皮供試液的提取方式為回流提取1h。

3.3 粉末粒徑的選擇 本試驗(yàn)考察2號(hào)篩、3號(hào)篩、4號(hào)篩不同篩目的粉末粒徑，結(jié)果顯示，2號(hào)篩樣品丹皮酚的重復(fù)性較3號(hào)篩、4號(hào)篩的差。3號(hào)篩與4號(hào)篩樣品的重復(fù)性總體情況良好，兩者含量相近，其芍藥苷峰信號(hào)均高2號(hào)篩粉末樣品，綜合考慮，確定選擇牡丹皮粉末粒徑為3號(hào)篩。

3.4 定容溶劑的選擇 本試驗(yàn)在稀釋定容過程中考察0%～100%的甲醇溶液，結(jié)果顯示，0%～40%的甲醇溶液稀釋的色譜圖中色譜峰數(shù)量較少，而60%～100%的甲醇溶液稀釋的部分色譜峰的峰型較差，分離度低，部分色譜峰出現(xiàn)裂峰，而50%的甲醇溶液稀釋較為良好，色譜峰數(shù)量較多，信息量較大。綜合考慮，確定選用50%的甲醇溶液進(jìn)行稀釋定容。

3.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本試驗(yàn)考察230nm、258nm、265nm、274nm、292nm等檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果顯示，檢測(cè)波長(zhǎng)為258～292nm，色譜峰數(shù)量減少，包括芍藥苷在內(nèi)的一些特征信息未表達(dá)出來;檢測(cè)波長(zhǎng)為335nm時(shí)，基本上只有丹皮酚一個(gè)色譜峰，而檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm時(shí)，色譜圖的峰數(shù)目、信息量較大，綜合考慮，確定選擇230 nm為牡丹皮的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地牡丹皮藥材質(zhì)量存在差異。山西運(yùn)城產(chǎn)地牡丹皮藥材中兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷和浸出物含量明顯高于其他產(chǎn)地，說明其藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)較高;安徽銅陵、南陵所產(chǎn)的牡丹皮藥材質(zhì)量排序第3、第4名，說明其藥材品質(zhì)較優(yōu)，這也與安徽銅陵和南陵為牡丹皮的道地產(chǎn)區(qū)相吻合;湖北恩施、重慶墊江、亳州、山東菏澤產(chǎn)地牡丹皮樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度排名靠后，說明其藥材質(zhì)量較差。

牡丹皮化學(xué)成分眾多，成分的多樣性致使其質(zhì)量很難控制，單一的指標(biāo)成分不能準(zhǔn)確反映牡丹皮的藥效和質(zhì)量，使其在分析評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量時(shí)損失信息量太多。本研究以相對(duì)關(guān)聯(lián)度為測(cè)度，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)分析法，建立一種牡丹皮藥材質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)的模型，客觀整體地反映牡丹皮藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為牡丹皮藥材的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新思路，也為牡丹皮資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

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