李世杰，肖思萌，何 毅，彭 贊，黎 芳，馬曉聰，梁健欽

慢性骨髓炎（chronic osteomyelitis）是骨科常見的疑難病種之一，治療周期長(zhǎng)、醫(yī)療成本高、治療效果差、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。據(jù)報(bào)道慢性骨髓炎最常見的致病菌是金黃色葡萄球菌屬的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA），且臨床檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，從2006年的28.7%上升到2018年的39.8%[1]，常通過清創(chuàng)后在骨缺損處植入混有抗生素的骨水泥填補(bǔ)空腔予以治療[2-3]。萬古霉素（vancomycin，VCM）骨水泥是最常用的抗生素骨水泥[4]，但其殺菌濃度只能保持2～4 w，且常用的骨水泥材料如聚甲基丙烯酸甲酯在體內(nèi)不能被降解[5]，VCM釋放完全后需再次手術(shù)取出。為了提高VCM的治療效果，可使用生物降解材料制備成緩釋制劑。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid)，PLGA）是一種生物可降解的聚合物，在人體內(nèi)可被降解為二氧化碳和水，由于其優(yōu)異的生物相容性常被用作制備微球的材料，是骨組織復(fù)合支架的理想材料之一[6]。多孔聚合物材料載藥后具有緩釋、靶向作用，更適合慢性骨髓炎的治療[7-8]。 羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人體骨骼組織的主要無機(jī)成分，用HA作為骨科用材料具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，同時(shí)HA還可作為Pickering乳液的一種乳化劑[9-10]。本研究以HA穩(wěn)定的Pickering乳液為模板，通過一步法制備PLGA多孔微球，通過吸附法裝載VCM得到載VCM的多孔微球，為開發(fā)治療骨髓炎的載抗生素新劑型或骨組織工程復(fù)合支架提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鹽酸萬古霉素（南京邦諾生物科技有限公司，批號(hào)20171201），(NH4)2HPO4（天津博迪化工股份有限公司），Ca(NO3)2（AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20170416），泊洛沙姆（F-68）（Sigma公司，批號(hào)018K0029），PLGA50/50（LA∶GA=50∶50，黏度0.25 dl/g，批號(hào)2017072802）、PLGA75/25（LA∶GA=75∶5， 黏度0.26 dl/g， 批號(hào)2017081102）、PLGA50/50（LA∶GA=50∶50，黏度0.38 dl/g，批號(hào)2018012401）、PLGA75/25（LA∶GA=75∶25，黏度0.45 dl/g，批號(hào)2018012402）均購自深圳市博立生物材料有限公司，水為純化水，其他試劑均為分析純。

MSP-2S磁控離子濺射儀（孚光精儀（中國(guó)）有限公司），Quanta 250掃描電子顯微鏡（FEI公司），BA210 Digital數(shù)碼顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），Nicolet iS50 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛世爾科技公司），TG209 F3熱重分析儀（德國(guó)NETZSCH公司），Zetasizer Nano ZSP納米粒度分析儀（英國(guó)馬爾文公司），ASAP2420-4比表面測(cè)定儀（美國(guó)麥克儀器公司），UV-9000紫外-可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HA的制備 分別稱取(NH4)2HPO42.56 g、Ca(NO3)27.52 g，置燒杯中，加水400 ml使溶解，將(NH4)2HPO4溶液緩慢加至Ca(NO3)2溶液中，攪拌，用氨水調(diào)pH值至10，靜置12 h，離心（2000 r/min）10 min，棄去上清液，加水使沉淀重新分散，再次離心，重復(fù)該步驟，至沉淀物無明顯氨味，取沉淀物，80℃干燥。

1.2.2 空白PLGA多孔微球的制備 （1）PLGA型號(hào)及用量：稱取不同規(guī)格PLGA（用量為0.25 g、0.50 g）和致孔劑F-68（按PLGA重量的10%計(jì)），置100 ml具塞錐形瓶中，加二氯甲烷5 ml，振搖至溶解，作為油相；稱取HA 0.1g，加水20 ml，超聲（45 KHz，200 W）10 min，使HA分散，作為水相。將水相加入到油相中，振搖10 min，得到Pickering乳液，置搖床（30℃水浴，120 r/min），振搖，揮去二氯甲烷，濾過，置P2O5干燥器干燥，得到空白PLGA多孔微球。（2）致孔劑（F-68）用量：按照上方（1）選定的PLGA型號(hào)和用量，加入F-68（按PLGA重量的1.5%、2.5%、5%、10%計(jì)算），按照上述方法制備空白PLGA多孔微球。

1.2.3 載VCM的PLGA多孔微球的制備 采用吸附法載藥。稱取空白PLGA多孔微球200 mg，4份，置于5 ml離心管中，分別加入濃度為50、100、150、200 mg/ml的VCM溶液，振搖24 h，過濾，濾渣置P2O5干燥器干燥。

1.2.4 多孔微球的表征 （1）傅里葉變換紅外光譜（FTIR）：分別取適量PLGA、HA、VCM、空白PLGA多孔微球、VCM-PLGA多孔微球進(jìn)行紅外波譜測(cè)定，波數(shù)范圍設(shè)置在400 cm-1～4000 cm-1，重復(fù)掃描16次。（2）差示掃描量熱（DSC）分析：分別取適量PLGA、HA、VCM、空白PLGA多孔微球、VCM-PLGA多孔微球、空白多孔微球與VCM物理混合物進(jìn)行差示掃描量熱分析，以10 K/min的速度進(jìn)行升溫，在25～600℃進(jìn)行差示量熱掃描，記錄圖譜。（3）粒度：分別取空白PLGA多孔微球、VCM-PLGA多孔微球，適量，配制成混懸液進(jìn)行粒度檢測(cè)。（4）比表面積及孔結(jié)構(gòu)測(cè)定：空白PLGA多孔微球的比表面積及孔結(jié)構(gòu)用比表面測(cè)定儀進(jìn)行表征。通過N2吸附-脫附等溫線的類型判斷孔結(jié)構(gòu)類型，并根據(jù)Barrett-Emmett-Teller（BET）方程[11]計(jì)算比表面積。

1.2.5 載藥量 稱取VCM-PLGA多孔微球50 mg，精密稱定，置5 ml離心管，加二氯甲烷2 ml，超聲（45 KHz，200 W）10 min，使微球完全溶解，靜置2 h，加水2 ml，萃取，靜置6 h，分取水層，重復(fù)萃取3次，合并水相，置10 ml容量瓶中，水浴60℃恒溫24 h顯色，室溫冷卻后加水定容至刻度，即得供試品溶液。采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定280 nm處的吸光度，用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算濃度[12]。按“載藥量=藥物的質(zhì)量/微球的質(zhì)量×100%”計(jì)算載藥量。

1.2.6 體外釋放度 分別稱取載VCM的多孔微球和VCM原料藥，3份，置20 ml離心管中，加入37℃預(yù)熱的PBS緩沖液20 ml，置搖床中，在120 r/min、37℃條件下振搖，分別在第0.5 h、1 h、2 h、3 h、5 h、10 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h取樣3 ml，測(cè)定280 nm處吸光度，并補(bǔ)足等體積PBS（37℃）。根據(jù)外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算VCM濃度，并按下式計(jì)算藥物累計(jì)釋放率（%）。式中：Qn為累計(jì)釋放率，C1,C2,…，Cn-1為第1，2，…(n-1)次取樣時(shí)的樣品濃度，W為載藥量。

2 結(jié)果

2.1 HA的制備 HA的形貌不規(guī)則顆粒，大小不一。見圖1。

圖1 HA的SEM圖

2.2 空白PLGA多孔微球的制備

2.2.1 PLGA型號(hào)及用量 PLGA用量為0.25 g時(shí)，得到的微球圓整，尤其是選用PLGA50/50（0.28dL/g）得到的微球圓整度好、多孔。因此，本實(shí)驗(yàn)選用的PLGA型號(hào)為PLGA50/50（0.28dL/g），用量0.25 g。 見圖2。

2.2.2 F-68用量考察 F-68用量為1.5%、2.5%的樣品成球率低，5%及10%的樣品成球率較高，其中5%的樣品球形更規(guī)整，因此確定F-68的最佳用量為5%。見圖3。

2.3 載VCM的PLGA多孔微球 吸附法載藥工藝中VCM濃度為200 mg/ml的樣品在靜置過程中逐漸凝固成蠟狀固體，故排除進(jìn)一步研究。另3個(gè)樣品的結(jié)果見圖4，載藥后仍維持原來的高成球率及孔結(jié)構(gòu)，且隨著吸附藥液的濃度升高，微球表面隨之變得粗糙。

2.4 多孔微球的表征

2.4.1 多孔微球的紅外光譜分析 HA在1016.01 cm-1處的P-O鍵非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰在合成空白PLGA多孔微球后藍(lán)移至1031.37 cm-1，載藥后，561.77 cm-1處O-P-O彎曲振動(dòng)峰的吸收強(qiáng)度大幅降低[13]。空白PLGA多孔微球保留了PLGA在1747.77 cm-1處的C=O伸縮振動(dòng)峰，載VCM后吸收強(qiáng)度降低[14]。見圖5。

圖2 多孔微球SEM圖（×6000）

圖3 空白PLGA多孔微球的SEM圖（×6000）

圖4 VCM-PLGA多孔微球SEM圖（×12000）

圖5 紅外光譜圖

2.4.2 差示掃描量熱 （DSC）分析 結(jié)果見圖6，HA在98.22℃有一個(gè)吸收峰，可能是樣品含有少量水分形成的蒸發(fā)吸熱峰；PLGA在53.09℃發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，在339.48℃有熔點(diǎn)吸收峰；空白PLGA多孔微球在50.84℃保留了PLGA的玻璃化吸熱峰，339.48℃處的熔點(diǎn)峰變平緩；VCM在79.40℃的吸熱峰可能為吸熱降解過程；VCM-PLGA多孔微球在55.21℃保留了PLGA的玻璃化吸熱峰且強(qiáng)度變大，應(yīng)是與VCM的降解峰重疊形成，PLGA的熔點(diǎn)峰右移至379.30℃處[14-16]。

圖6 差示熱分析圖

2.4.3 粒度 空白PLGA多孔微球及VCM-PLGA多孔微球的粒度平均值分別為9.77μm、9.53μm。

2.4.4 比表面積及孔結(jié)構(gòu)測(cè)定 結(jié)果見圖7。樣品的吸附曲線與脫附曲線不一致，出現(xiàn)遲滯回線，屬于國(guó)際純粹應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)提出的物理吸附等溫線類型中的Ⅳ型曲線，表明樣品中存在介孔結(jié)構(gòu)。根據(jù)BET方程進(jìn)行計(jì)算，空白PLGA多孔微球的比表面積為22.1643 m2/g。

圖7 N2吸附-脫附等溫線

2.5 載藥量 吸附法載藥中VCM濃度分別為50、100、150 mg/ml時(shí)，微球的平均載藥量分別為4.67%±0.06%、6.62%±0.20%、7.56%±0.22%，組間比較均有顯著差異（P＜0.05）。

2.6 體外釋放度 VCM原料藥0.5 h累計(jì)釋放量為91.74%，1 h達(dá)到97.68%，藥物在1 h內(nèi)基本已完全釋放。VCM-PLGA多孔微球在0.5 h累計(jì)釋放量為64.94%，在5 h達(dá)到92.28%，大部分藥物已被釋放到溶液中。兩組進(jìn)行比較，微球組在3 h之內(nèi)與原料藥組有顯著性差異（P＜0.05），具有緩釋作用。見圖8。

圖8 VCM-PLGA多孔微球體外釋放試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)制備空白PLGA多孔微球的最佳制備處方和工藝為：以5 ml二氯甲烷、0.25 g PLGA（LA∶GA=50∶50，黏度：0.38 dl/g）、0.0125 g F-68為油相，以20 ml水、0.1 g HA為水相，兩相混合振搖10 min得到Pickering乳液，置搖床（30℃水浴，120 r/min）振搖揮去二氯甲烷，濾過，干燥。接著，SEM可見該工藝下制備得到的微球具有豐富的孔，平均粒徑約10μm，比表面積測(cè)定同樣提示微球內(nèi)部存在豐富的介孔結(jié)構(gòu)，比表面積為22.1643 m2/g。最后，在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，VCM-PLGA多孔微球已經(jīng)具有一定緩釋作用。

綜上所述，采用Pickering乳液模板法制備的PLGA多孔微球具有豐富的介孔結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是裝載藥物的主要場(chǎng)所；制備方法簡(jiǎn)便，只需經(jīng)過一次乳化便能制備多孔微球，大幅提高制備效率且降低了制備所需條件水平；裝載VCM的多孔微球已具有緩釋作用，所用材料均為生物相容性高的材料，后期可以將載VCM的PLGA多孔微球進(jìn)一步通過熔融燒結(jié)方法，制備得到骨組織復(fù)合支架，具備應(yīng)用于骨科疾病治療的潛力。