楊 濛，丁 輝

急性冠脈綜合征是目前我國居民死亡和影響傷殘調(diào)整生命年的首位原因，且隨著人口老齡化其對傷殘調(diào)整生命年的影響還在逐年上升[1]。急性冠脈綜合征的診斷主要從癥狀、心電圖及心肌損傷標(biāo)志物三方面考慮，而非ST段抬高心肌梗死（NSTEMI）由于沒有典型心電圖表現(xiàn)診斷更為困難[2]，目前高敏心肌肌鈣蛋白（hs-cTnI）為NSTEMI唯一推薦的血清學(xué)診斷標(biāo)志物，但由于其與心肌損傷相關(guān)，除心肌梗死外，在心肌炎、心包炎、肺栓塞等多種疾病中也可升高，診斷特異度欠佳，仍有待開發(fā)針對NSTEMI的特異性標(biāo)志物[3]。外泌體是直徑30～150 nm的細(xì)胞外囊泡，由于其中可裝載各種細(xì)胞內(nèi)組分如蛋白質(zhì)、RNA、脂質(zhì)已成為多種疾病的候選診斷標(biāo)志物[4-6]，通過對NSTEMI患者外周血外泌體的篩選筆者發(fā)現(xiàn)微小RNA miR-320的表達(dá)上調(diào)，本研究將進(jìn)一步探討循環(huán)血外泌體miR-320對NSTEMI的鑒別診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續(xù)納入2017年1月～2019年7月醫(yī)院收治的NSTEMI患者112例作為觀察組訓(xùn)練集，同期納入非心肌梗死患者37例作為對照組，其中病毒性心肌炎12例，急性肺栓塞25例；納入2019年8月～2020年12月醫(yī)院收治的NSTEMI患者75例作為觀察組測試集，同期納入非心肌梗死患者21例作為對照組，其中病毒性心肌炎9例，急性肺栓塞12例。所有患者入院后收集年齡、性別、BMI、血脂情況、高血壓及糖尿病史、肝腎功能、凝血功能及心肌損傷標(biāo)志物水平。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有典型癥狀及心電圖改變或有缺血性胸痛病史；（2）年齡≥18歲；（3）發(fā)病時間12～24 h；（4）冠狀動脈造影顯示心電圖缺血導(dǎo)聯(lián)對應(yīng)的冠脈管腔狹窄≥50%，符合上述全部選項者納入本研究。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）出現(xiàn)典型癥狀及心電圖改變；（2）年齡≥18歲；（3）發(fā)病時間12～24 h；（4）3 w內(nèi)有病毒感染癥狀，如乏力、發(fā)熱、頭痛等；（5）CT肺動脈造影確診為急性肺栓塞。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）冠狀動脈痙攣、心肌橋、冠狀動脈畸形以及繼發(fā)因素導(dǎo)致的急性心肌梗死患者；（2）合并甲亢、貧血等代謝性疾?。唬?）妊娠期婦女；（5）合并急慢性感染；（6）心源性休克；（7）合并嚴(yán)重肝腎功能不全；（8）臨床數(shù)據(jù)不完整，依從性差。符合上述任1選項者不納入本研究。本研究已上報醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 外周血外泌體提取與鑒定 患者入院時抽取5 ml外周靜脈血，在4℃下500 r/min離心15 min后收集血清，使用exoRNeasy Serum/Plasma Midi試劑盒（中國上海，Qiagen公司，貨號77044）和超速離心（中國上海，Beckman公司，Optima TM L-80 XP）120 000 r/min離心80 min提取外泌體，剩余血漿用PBS（1∶1）稀釋用作對照，通過ZetaviewTM納米生物顆粒分析儀對外泌體的布朗運(yùn)動進(jìn)行追蹤和分析，結(jié)合Stockers-Eiustein方程計算外泌體的流體力學(xué)直徑和濃度。

1.4 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 將RNeasy MinElute離心柱放入1.5 ml收集管中，在離心柱膜中央加入14μl無核酶水，靜置1 min，然后25℃下5000 r/min離心1 min洗脫總RNA，超微量分光光度計（中國上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號NanoDrop2000）測定總RNA濃度及純度。取RNA 0.5μg使用SuperScriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國上海,賽默飛公司,貨號18080044)合成miRNA的互補(bǔ)DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，莖環(huán)引物序列：5'-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA GTG AA-3'。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR 使用TransStartRTop Green qPCR SuperMix試劑盒(中國北京，全式金生物技術(shù)有限公司,貨號AQ132-21)對miR-320進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，PCR反應(yīng)在LightCycler480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR系統(tǒng)(中國上海，羅氏公司)上進(jìn)行，以U6作為內(nèi)參，正向引物：5'-GCA CTT TAT TGG TCC ATC ATC C-3'； 反 向 引 物 ：5'-GAC ACC TGG CTC TTT TTG ATT C-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)后通過Ct值，即熒光強(qiáng)度達(dá)到給定閾值時所需的循環(huán)數(shù)并計算2-△△CT來定量microRNA的表達(dá)，miR-320正向引物：5'-ACA CTC C AG CTG GGA AAA GCT GGG TTG AGA-3'；反向引物：5'-TGG TGT CGT GGA GTCG-3'。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例和百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；使用皮爾遜線性相關(guān)分析兩計量資料間的相關(guān)性；使用受試者工作特征曲線（ROC）及其曲線下面積（area under the curve,AUC）評估診斷效能，ROC之間比較采用Z檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基線資料 觀察組BMI、血脂異常比例、hs-cTnI、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶及血清miR-320相對表達(dá)量均高于對照組，D二聚體水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 miR-320與hs-TnI水平的相關(guān)性 觀察組miR-320表達(dá)量與hs-TnI水平相關(guān)系數(shù)為0.831(95%可信區(qū)間0.782～0.871，P＜0.001）， 對照組miR-320表達(dá)量與hs-TnI水平相關(guān)系數(shù)為0.383(95%可信區(qū)間0.138～0.583，P＜0.01），見圖1。

2.3 訓(xùn)練集中miR-320及hs-cTnI的診斷效能miR-320診斷NSTEMI的AUC值為0.899(95%可信區(qū)間0.839～0.943），高于hs-cTnI的0.739(95%可信區(qū)間0.661～0.808)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=3.100，P＜0.01），見圖2。根據(jù)ROC曲線確定的miR-320和hs-cTnI最佳靈敏度和特異度下截斷值分別為1.14和0.18 ng/ml。miR-320診斷NSTEMI的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比及正確指數(shù)分別為79.4%、91.9%、9.80、0.22、0.64；hs-cTnI診斷NSTEMI的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比及正確指數(shù)分別為73.2%、70.3%、2.46、0.38、0.43。

2.4 miR-320及hs-cTnI的診斷效能測試miR-320診斷NSTEMI的AUC值為0.876(95%可信區(qū)間0.792～0.934），高于hs-cTnI的0.778(95%可信區(qū)間0.681～0.856)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.639，P=0.032），見圖3。使用訓(xùn)練集miR-320最佳截斷值miR-320診斷NSTEMI的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比及正確指數(shù)分別為73.3%、90.5%、7.70、0.29、0.64；hs-cTnI診斷NSTEMI的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比及正確指數(shù)分別為42.7%、95.2%、8.96、0.60、0.38。

表1 研究對象基線資料比較

圖1 miR-320與hs-TnI水平的相關(guān)性

圖2 miR-320及hs-TnI診斷NSTEMI的ROC曲線

圖3 測試集ROC曲線

3 討論

hs-TnI診斷NSTEMI的內(nèi)部真實(shí)性已得到了充分的驗(yàn)證，其區(qū)分NSTEMI與不穩(wěn)定心絞痛的特異度和敏感度均達(dá)90%以上[7]，然而，對于其外部真實(shí)性如與心肌損傷相關(guān)疾病的鑒別診斷效能仍未得到充分證實(shí)，目前已有文獻(xiàn)報道hs-TnI也會受到其他心臟疾病如心肌炎、心包炎、主動脈夾層，免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及尿毒癥、膿毒癥等諸多疾病的干擾[8]，其中病毒性心肌炎及肺栓塞由于與NSTEMI癥狀相似極易誤診，因此人們重點(diǎn)關(guān)注病毒性心肌炎及肺栓塞與NSTEMI的鑒別診斷。

從基線資料來看，觀察組BMI、血脂異常比例均高于對照組，這在于兩者均為NSTEMI發(fā)病的重要危險因素，而hs-cTnI、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶作為心肌損傷標(biāo)志物同樣在NSTEMI組中升高，D二聚體水平作為提示肺栓塞的重要標(biāo)志物，其在對照組中升高與臨床經(jīng)驗(yàn)相符。更重要的是，觀察組miR-320相對表達(dá)量高于對照組，這與本研究預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果一致，先前Zhang等[9]的研究指出miR-320在缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖心肌細(xì)胞模型中發(fā)揮誘導(dǎo)損傷的作用，Li等[10]的研究則發(fā)現(xiàn)miR-320可加劇高血糖引起的心臟功能障礙，類似Yang等[11]的研究指出miR-320可拮抗胰島素介導(dǎo)的心臟保護(hù)作用，這些結(jié)果均提示miR-320在缺血性心臟病中的上調(diào)是其病理生理過程中重要的環(huán)節(jié)，此外，根據(jù)這些研究的結(jié)果miR-320對心肌損傷的介導(dǎo)作涉及多種轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA及PI3K/Akt/mTOR信號通路等與hs-TnI不同的分子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，這可能是其表現(xiàn)出相比hs-TnI更具鑒別診斷價值的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)。

盡管miR-320在心肌損傷中的作用已有少量文獻(xiàn)報道，但其在臨床樣本尤其是外周血外泌體中的表達(dá)尚未見研究報道，事實(shí)上外泌體發(fā)揮著載體及膜屏障的作用從而富集并且保護(hù)微小RNA免受免疫系統(tǒng)攻擊，因此從其已成為檢測外周血微小RNA表達(dá)的重要媒介[12]。目前已報道有數(shù)種外泌體微小RNA如miR-21、miR-183、miR-204有潛在的心肌梗死診斷及病情監(jiān)測價值[13-15]，本研究結(jié)果顯示miR-320在NSTEMI與病毒性心肌炎和肺栓塞的鑒別診斷中有著高于hs-cTnI的診斷效能，在訓(xùn)練集和測試集中hs-cTnI診斷特異度存在較大波動，說明其在此類鑒別診斷患者中易受到患者個體差異的影響，易出現(xiàn)假陽性，而miR-320與其相比效能更為穩(wěn)定且有效彌補(bǔ)了其診斷特異度上的不足，有助于排除假陽性患者，而從相關(guān)性分析結(jié)果來看兩者在觀察組患者中具有較好相關(guān)性但在對照組中相關(guān)性欠佳，這可能在于病毒性心肌炎和肺栓塞與心肌梗死在病理生理機(jī)制上的差異，病毒性心肌炎心肌損傷的機(jī)制主要來自于機(jī)體對病毒的異常免疫應(yīng)答，而肺栓塞導(dǎo)致hs-cTnI升高的原因可能在于繼發(fā)于肺動脈阻力增加的急性右心室應(yīng)激及通氣-灌流失衡，未來對miR-320介導(dǎo)心肌損傷機(jī)制研究的進(jìn)展將有助于揭示這些結(jié)果的內(nèi)在原因。

本研究主要不足指之處在于受本中心臨床病例的限制，盡管設(shè)計了訓(xùn)練集及測試集探討miR-320的診斷價值，但未能安排驗(yàn)證集，后續(xù)研究有必要納入其他中心病例作為外部驗(yàn)證，此外，各指南及文獻(xiàn)均指出hs-TnI在腎功能不全患者中診斷效能受到極大限制[16]，而miR-320是否能改善這一缺陷有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討，最后，臨床中偶可出現(xiàn)肺栓塞與心肌梗死并發(fā)的病例如Leriche綜合征，極易造成漏診[17]，由于受到樣本量限制對此類患者的診斷有賴于進(jìn)一步研究跟進(jìn)。

綜上所述，循環(huán)血外泌體miR-320能有效區(qū)分NSTEMI與病毒性心肌炎和急性肺栓塞患者，對NSTEMI的鑒別診斷有較好應(yīng)用前景。