陳秀 陳甘瀟 張中和 胡丹 夏豪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 湖北省心臟重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430060)

早期復(fù)極模式(early repolarization pattern，ERP)是指除外V1～V3導(dǎo)聯(lián)，12導(dǎo)聯(lián)心電圖上≥2個(gè)相鄰導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)J波(QRS波群終末切跡或頓挫)頂點(diǎn)(Jp)振幅≥0.1mV，QRS波群時(shí)限(在無切跡或頓挫的導(dǎo)聯(lián)上)<120 ms，伴或不伴ST段抬高。過去幾十年一直被認(rèn)為是一種良性心電圖改變[1-2]。直到2000年，Gussak等[3]通過建立犬心室的楔形組織模型提出，這種“良性表現(xiàn)”有發(fā)展為多形性室性心動過速(室速)甚至心室顫動(室顫)的傾向。8年后，Ha?ssaguerre等通過多個(gè)臨床研究證實(shí)了這一假說[4-6]。隨后大量流行病學(xué)調(diào)查研究也發(fā)現(xiàn)，ERP(尤其是位于下/側(cè)壁)會增加惡性心律失常事件和心源性猝死的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。心電圖下壁和/或側(cè)壁導(dǎo)聯(lián)記錄到ERP，并伴有心搏驟停幸存史或室速/室顫史的患者即可被診斷為早期復(fù)極綜合征(early repolarization syndrome，ERS)。ERS具有明顯的家族遺傳傾向，目前已發(fā)現(xiàn)的與ERS有關(guān)的離子通道異?；蛴校篕CNJ8、CACNA1C、CACNB2b、CACNA2D1、ABCC9、SCN5A、SCN10A和KCND3[9-15]。但目前僅對一小部分已識別的突變進(jìn)行了功能表達(dá)的研究，確定了這些突變與ERS的因果關(guān)系及較為合理的致病機(jī)制。本研究利用二代測序技術(shù)、全細(xì)胞膜片鉗、共聚焦熒光顯微鏡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探究CACNA1C-P817S突變與ERS的因果關(guān)系及其可能的致病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 病例收集與遺傳學(xué)分析

本研究遵循赫爾辛基宣言和本單位倫理學(xué)規(guī)章制度，患者簽署知情同意書。收集就診于武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科的ERS患者，入選標(biāo)準(zhǔn)：心電圖下壁和/或側(cè)壁導(dǎo)聯(lián)記錄到ERP，并伴有心搏驟停幸存史或室速/室顫史者；ERP：除外V1～V3導(dǎo)聯(lián)，12導(dǎo)聯(lián)心電圖上≥2個(gè)相鄰導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)J波(QRS波群終末切跡或頓挫)頂點(diǎn)(Jp)振幅≥0.1 mV，QRS波群時(shí)限(在無切跡或頓挫的導(dǎo)聯(lián)上)<120 ms，伴或不伴ST段抬高[1-2]。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有患者需排除ST段抬高心肌梗死、心室動脈瘤、心包疾病、電解質(zhì)紊亂(高鉀和低鈣等)、體溫過低、致心律失常型右心室心肌病等其他原因?qū)е碌腟T段異常抬高。臨床評估包括：病史、詳細(xì)的體格檢查、血液檢查、心電圖、超聲心動圖和冠狀動脈造影。收集其外周血樣本，從外周血白細(xì)胞中提取DNA，采用二代測序技術(shù)，對常見致心肌早期復(fù)極的候選基因(KCNJ8、CACNA1C、CACNB2b、CACNA2D1、ABCC9、SCN5A、SCN10A和KCND3)進(jìn)行測序。這些候選基因的確定是基于既往報(bào)道的致ERS的突變基因。PCR擴(kuò)增候選基因的外顯子及外顯子與內(nèi)含子的接頭序列，將純化的PCR產(chǎn)物于ABI 3730遺傳分析儀(Applied Biosystem，美國)上進(jìn)行循環(huán)測序，測序結(jié)果由Mutation Surveyor V4.0.8軟件(Softgenetics，美國)進(jìn)行分析，并重復(fù)以上程序再次確認(rèn)。被認(rèn)為具有致病性的新突變?yōu)椋?1)終止/移碼突變；(2)錯(cuò)義突變位于物種間氨基酸保守區(qū)域；(3)符合GT-AT法則的剪切位點(diǎn)突變；(4)對照人群中最小等位基因頻率(MAF)<0.005；和/或(5)通過PolyPhen-2和MetaLR軟件預(yù)測可能有害或致病的突變。

1.2 HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將野生型(WT)和攜帶突變的CACNA1C全長cDNA序列克隆于帶有增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)的pcDNA3.1載體，構(gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒。同時(shí)將WT-CACNB2b和CACNA2D1全長cDNA序列克隆于pcDNA3.1載體，構(gòu)建WT-CACNB2b和WT-CACNA2D1質(zhì)粒。將3種質(zhì)粒按1∶1∶1的比例，按照Lipofectamine 2000說明書用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Life Technologies，美國)共轉(zhuǎn)染入人胚腎293(HEK293)細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫，中國)。

1.3 細(xì)胞電生理檢測

選取轉(zhuǎn)染后48～72 h，在倒置熒光顯微鏡(IX70，Olympus，日本)下觀察，為單個(gè)獨(dú)立、表面光滑、形態(tài)良好且貼壁牢固的帶有黃色熒光的細(xì)胞，置于配置好的細(xì)胞外液中(MgCl21 mmol/L、CaCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、TEA 150 mmol/L，CsOH調(diào)節(jié)pH至7.35)。全細(xì)胞膜片鉗系統(tǒng)使用AXON-700B膜片鉗放大器(Axon Instruments，美國)來記錄ICa，全過程在室溫(20～23 ℃)下進(jìn)行。連接膜片鉗放大器與計(jì)算機(jī)，由pCLAMP 10.4軟件(Axon Instruments，美國)控制，Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon Instruments，美國)采集信號。玻璃微電極充灌電極內(nèi)液后(CsCl 110 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Mg-ATP 2 mmol/L、TEA 10 mmol/L，CsOH調(diào)節(jié)pH至7.35)，對選取的細(xì)胞進(jìn)行負(fù)壓封接和破膜，形成全細(xì)胞記錄模式，記錄ICa。補(bǔ)充細(xì)胞膜電容，串聯(lián)電阻自動進(jìn)行補(bǔ)償70%～80%。保持電位為-90 mV，命令電位依次為-60～+60 mV，測試脈沖400 ms，步階10 mV，在以脈沖電壓為橫軸，電流密度(電流值/細(xì)胞膜電容)為縱軸，繪制電流-電壓(I-V)曲線。保持電位為-90 mV，命令電位依次為-60～+60 mV，測試脈沖400 ms，步階10 mV，以脈沖電壓為橫軸，G/Gmax為縱軸[G=Itp/(Vm-VR)]，繪制電壓依賴的穩(wěn)態(tài)激活(steady-state activation，SSA)曲線，采用Boltzmann方程對SSA曲線進(jìn)行擬合：G/Gmax=1+exp[(Vm-V1/2)/k]。保持電位為-90 mV，命令電位依次為-100～+20 mV，測試脈沖400 ms，步階10 mV，以脈沖電壓為橫軸，I/Imax為縱軸，繪制電壓依賴的穩(wěn)態(tài)失活(steady-state inactivation，SSI)曲線，采用Boltzmann方程對SSI曲線進(jìn)行擬合：I/Imax=1+exp[(Vm-V1/2)/k]。G為全細(xì)胞通道激活電導(dǎo)，Gmax為全細(xì)胞通道最大激活電導(dǎo)，Itp為不同電壓下全細(xì)胞峰值電流，VR為通道的反轉(zhuǎn)電位，Imax為電流最大值，Vm為去極化脈沖電壓，V1/2為半激活/半失活電壓，k為斜率因子。

1.4 共聚焦熒光顯微鏡檢測

選取轉(zhuǎn)染后48 h的帶有pEYFP黃色熒光的HEK293細(xì)胞，放在共聚焦熒光顯微鏡(TCS SP8，Leica Microsystems，德國)下采集熒光圖像。在XYZ三維層面上檢測分析EYFP標(biāo)記的細(xì)胞，限定細(xì)胞膜2 μm區(qū)域?yàn)橥庵苋旧謩e測量外周和細(xì)胞整體平均熒光強(qiáng)度，并計(jì)算外周與整體平均熒光強(qiáng)度的比值，測量結(jié)果直接用測量得到的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，未標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞面積后的值進(jìn)行比較。圖片使用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析

先證者是1例20歲男性青年，兩次運(yùn)動過程中發(fā)生暈厥史。常規(guī)心電圖提示(如圖1)：竇性心動過緩(HR=46次/min)，QRS=98 ms，QTc=367 ms，Ⅱ、Ⅲ、aVF、V2～V6導(dǎo)聯(lián)J波抬高均≥0.1 mV，其中Ⅱ、Ⅲ和aVF導(dǎo)聯(lián)抬高≥0.2 mV，V2～V5導(dǎo)聯(lián)可見ST段呈上斜型抬高，排除了引起ST段異常抬高的其他可能原因，包括急性心肌梗死和心室動脈瘤等。體格檢查未發(fā)現(xiàn)異常；超聲檢查提示右房和右室輕度擴(kuò)大，左室和右室射血分?jǐn)?shù)均正常；既往無心搏驟停史，否認(rèn)ERS和心源性猝死家族史。

2.2 遺傳學(xué)分析

該ERS先證者致病基因?yàn)榫幋aL型鈣離子通道(LTCC)的α1亞單位CACNA1C，為錯(cuò)義突變，且位于氨基酸保守區(qū)域。突變位于17號外顯子上核苷酸2449區(qū)，胞嘧啶C突變成胸腺嘧啶T(c.2449 C>T)，使脯氨酸(P)被絲氨酸(S)所替代(P817S)，Cav1.2的DⅡ/Ⅲ結(jié)構(gòu)域。MAF為0.002，PolyPhen-2(評分為0.997)、MetaLR軟件(評分為0.839)預(yù)測可能為有害突變。

圖1 ERS先證者常規(guī)心電圖(25 mm/s，10 mm/mV)

2.3 細(xì)胞電生理檢測

2.3.1CACNA1C-P817S突變對I-V曲線的影響

如圖2，P817S組ICa密度較WT組顯著降低，在0 mV時(shí)峰電流密度降低了約68.8%，從(-19.2±1.5)pA/pF降至(-6.0±1.7)pA/pF。

2.3.2CACNA1C-P817S突變對ICaSSA曲線的影響

如圖3A-C，兩組SSA曲線無明顯差異，半激活電壓V1/2分別為WT組(11.3±1.5)mV和P817S組(12.5±1.5)mV，SSA曲線斜率k也無明顯改變(WT vs P817S：6.3±1.0 vs 6.5±1.3，P>0.05)。

2.3.3CACNA1C-P817S突變對ICaSSI曲線的影響

如圖3D-F，P817S突變使半失活電壓V1/2明顯減小，V1/2由(-30.4±0.75) mV變?yōu)?-41.6±0.84) mV，但失活曲線斜率k保持不變(WT vs P817S：7.4 ± 1.1 vs 6.5 ± 1.3，P>0.05)。提示CACNA1C-P817S突變加速了LTCC的穩(wěn)態(tài)失活。

2.4 轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究

與WT組相比，P817S組Cav1.2蛋白外周熒光強(qiáng)度的絕對值明顯降低[WT vs P817S：(19.6±2.0)MD vs (12.2±1.9)MD，P<0.01]，如圖3C。P817S組Cav1.2蛋白外周/整體熒光強(qiáng)度的百分比也較WT組降低(WT vs P817S：(30.2±2.3)% vs (20.9±2.2)%，P<0.01，n=4)，如圖3D,提示P817S突變組細(xì)胞Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低。

3 討論

離子通道疾病是年齡<30歲人群中心源性猝死的主要原因，而基因和分子是這類疾病的決定性因素[16-17]。ERS作為離子通道疾病的一種，如前所述，其心電圖表現(xiàn)即ERP一直被認(rèn)為是一種良性表現(xiàn)，一直到2008年，Ha?ssaguerre等[4]的開創(chuàng)性研究發(fā)現(xiàn)ERS與惡性心律失常及心源性猝死相關(guān)。2013年，ERS在《2013 HRS/EHRA/APHRS遺傳性心律失常綜合征診治專家共識》中首次作為一種獨(dú)立的遺傳心律失常被提出[18]。目前發(fā)現(xiàn)與ERS相關(guān)的離子通道有3種(IK-ATP、ICa-L和INa)，相關(guān)的基因突變有KCNJ8、CACNA1C、CACNB2b、CACNA2D1、ABCC9、SCN5A、SCN10A和KCND3。但目前僅對一小部分已識別的突變進(jìn)行了功能表達(dá)的研究，確定了這些突變與ERS的因果關(guān)系以及較為合理的致病機(jī)制。因此，對基因突變的功能性和生物學(xué)驗(yàn)證是基因檢測結(jié)果解讀的環(huán)節(jié)。本研究通過對CACNA1C-P817S突變進(jìn)行了相應(yīng)的功能性和生物學(xué)研究，探究CACNA1C-P817S突變與ERS的因果關(guān)系及其可能的致病機(jī)制。

注：A和B為兩組細(xì)胞ICa原始電流曲線記錄圖；C為兩組細(xì)胞的I-V曲線，每個(gè)點(diǎn)的值為為在0 mV時(shí)記錄的兩組ICa峰電流密度的比較。***表示P<0.001(WT vs P817S)。圖2 CACNA1C-P817S突變對ICa的影響

注：A表示W(wǎng)T和P817S突變的SSA曲線；B為兩組SSA曲線半激活電壓V1/2的比較；C為兩組SSA曲線斜率因子k的比較；D表示W(wǎng)T和P817S突變的SSI曲線；E為兩組SSI曲線半失活電壓V1/2的比較；F為兩組SSI曲線斜率因子k的比較。***表示P<0.001，NS表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(WT vs P817S)。圖3 CACNA1C-P817S突變對SSA曲線和SSI曲線的影響

注：圖A和B分別表示兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光染色圖像，黃色熒光顯色部分代表Cav1.2蛋白；圖C表示兩組細(xì)胞Cav1.2蛋白外周熒光強(qiáng)度的絕對值比較；圖D表示兩組細(xì)胞Cav1.2蛋白外周/整體熒光強(qiáng)度百分比的比較。**表示P<0.01(WT vs P817S)。圖4 共聚焦熒光顯微鏡下HEK293細(xì)胞Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能的比較

ERS的電生理機(jī)制一直存在爭議，但近來Koncz等[19]的ERS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑閺?fù)極化假說提供了證據(jù)：Ito是引起1期快速復(fù)極的主要跨膜電流，相對于心內(nèi)膜，心外膜有更多的Ito通道；正常情況下，心外膜動作電位1相外向電流強(qiáng)于心內(nèi)膜，因此心外膜在動作電位1相時(shí)表現(xiàn)為更為明顯的切跡，而心內(nèi)膜動作電位尖峰通常較細(xì)小，形成跨室壁的電壓梯度，ERS患者跨室壁電壓梯度會增大，進(jìn)而出現(xiàn)J點(diǎn)抬高、明顯J波或QRS波群終末的頓挫；心動過緩時(shí)，迷走神經(jīng)張力增加，可使IK-ATP激活，導(dǎo)致心室Ito增強(qiáng)，誘發(fā)心動過緩相關(guān)性J波；而睪酮在增強(qiáng)IKs的同時(shí)抑制ICa，使外向電流明顯增強(qiáng)，J波振幅增高[20-22]。因此ERS多見于男性青壯年，同時(shí)也有研究表明心動過緩和長間歇可使J波和ST段抬高更加明顯[23-24]。此外，LTCC基因突變可使ERS患者QT間期相對縮短[10]。本研究ERS先證者為一男性青年，臨床特征與既往研究相符；既往無心搏驟停史，也否認(rèn)ERS和心源性猝死家族史，但常規(guī)心電圖可見多個(gè)導(dǎo)聯(lián)J波抬高≥0.1 mV，甚至所有下壁和側(cè)壁導(dǎo)聯(lián)V4均≥0.2 mV，同時(shí)多個(gè)導(dǎo)聯(lián)可見ST段抬高，考慮可能為心動過緩相關(guān)性J波；先證者暈厥發(fā)生在運(yùn)動過程中，而ERP又出現(xiàn)在心動過緩時(shí)，考慮可能是運(yùn)動后恢復(fù)期迷走神經(jīng)介導(dǎo)，類似于心動過緩性J波。Rosso等[6]發(fā)現(xiàn)，心電圖存在J波的人群出現(xiàn)室顫的概率為11/10萬，因此ERS的高度危險(xiǎn)性引起了關(guān)注，早期篩查高危ERS人群尤為重要。ERS高危因素有：(1)家族人群中存在ERS，且具有不明原因的暈厥及猝死者；(2)可能出現(xiàn)過因室速或室顫導(dǎo)致的暈厥或心臟事件；(3)當(dāng)QRS波群終末部分出現(xiàn)頓挫，且J波明顯抬高伴隨T波倒置；(4)左室下壁、下側(cè)壁或所有導(dǎo)聯(lián)均出現(xiàn)J波或ST段抬高≥0.2 mV；(5)運(yùn)動后恢復(fù)期迷走神經(jīng)介導(dǎo)的ST段抬高也預(yù)示著惡性改變等[1，25]。先證者下壁導(dǎo)聯(lián)J波抬高均≥0.2 mV，同時(shí)又可能是運(yùn)動后恢復(fù)期迷走神經(jīng)介導(dǎo)，故先證者屬于高危ERS，可能有更高發(fā)生惡性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，需隨訪來進(jìn)一步研究。先證者QTc為367 ms，相對較短，推測為LTCC基因突變的可能性較大。通過二代測序技術(shù)，證實(shí)確為編碼LTCC α1亞單位CACNA1C發(fā)生了錯(cuò)義突變，c.2449 C>T/p.P817S，MAF為0.002，PolyPhen-2和MetaLR軟件預(yù)測為有害突變。

LTCC有CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3和CaV1.4四種亞型，心肌細(xì)胞主要表達(dá)CaV1.2亞型，由α1、β2、α2δ和/或γ亞基四種亞基組成。α1亞基的編碼基因是位于12號染色體上的CACNA1C，為離子轉(zhuǎn)運(yùn)孔道，也是LTCC功能和藥理學(xué)特性的決定性蛋白，但LTCC功能表達(dá)需β2和α2δ亞基的輔助，以提高細(xì)胞膜表達(dá)密度，順應(yīng)細(xì)胞內(nèi)信使調(diào)控[10，26]。CACNA1C突變可導(dǎo)致長Q-T間期綜合征、Brugada綜合征、ERS以及短Q-T間期綜合征。但在既往研究報(bào)道中，功能性缺失較少見。Cav1.2羧基末端的突變可能對Cav1.2功能表達(dá)和蛋白表達(dá)水平有明顯作用，心臟疾病相關(guān)CACNA1C基因突變在Cav1.2多見于羧基末端，且該區(qū)域的突變多產(chǎn)生功能喪失性效應(yīng)，而發(fā)生在跨膜區(qū)域的突變較為少見[10，27]。ICa大小不僅和離子通道活性有關(guān)，還與細(xì)胞膜上的通道數(shù)量有關(guān)，這取決于Cav1.2蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。Antzelevitch等[28]發(fā)現(xiàn)CACNA1C-A39V突變導(dǎo)致的ICa功能性缺失是由于該突變降低了Cav1.2蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。如前所述，睪酮在增強(qiáng)IKs的同時(shí)抑制ICa，使外向電流明顯增強(qiáng)，J波振幅增高。先證者為一男性青年，致病突變又為LTCC基因突變，理論上，睪酮和CACNA1C突變的雙重作用，會使臨床癥狀更明顯和更嚴(yán)重，但目前癥狀表明并沒有，可能是因?yàn)榇嬖趥€(gè)人易感性的可能，當(dāng)然，這也在一定程度上提示了該先證者有癥狀惡化的可能，需密切注意。既往研究發(fā)現(xiàn)，CACNA1C突變可使ICa功能缺失，從而表現(xiàn)為ERS[10]。本研究通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對CACNA1C-P817S進(jìn)行功能學(xué)研究，結(jié)果顯示P817S突變可降低ICa密度，加速LTCC的失活，但并未改變激活。為進(jìn)一步研究ICa密度的降低是否是Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低所致，本研究通過共聚焦熒光顯微鏡技術(shù)，通過對Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)P817S突變可使Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低，于是可對細(xì)胞電生理結(jié)果中P817S突變組中ICa密度的降低作出較為合理的解釋：P817S突變通過降低Cav1.2蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，使細(xì)胞膜上有效Cav1.2蛋白數(shù)量減少，從而降低了ICa的密度。

綜上，本研究通過對ERS先證者進(jìn)行基因篩查，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的基因突變CACNA1C-P817S，通過功能分析證實(shí)為功能缺失性突變，該突變通過降低Cav1.2蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，使細(xì)胞膜上有效Cav1.2蛋白數(shù)量減少，從而降低了ICa的密度。本研究結(jié)果提示，CACNA1C-P817S突變?yōu)镋RS的一個(gè)致病基因，明確ERS的分子遺傳學(xué)和功能學(xué)基礎(chǔ)可為其診斷和治療提供一定的依據(jù)。

4 限制與不足

本研究的局限性是缺乏來自先證者的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞以及進(jìn)一步的體內(nèi)研究，而這對于解釋復(fù)雜遺傳變異的累積效應(yīng)是優(yōu)選。另一局限性是，本研究缺乏蛋白定量相關(guān)的研究，這可能在部分程度上對試驗(yàn)結(jié)果造成偏倚。