周建偉 白玉龍 李淼 沈亞俊 李矛

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院骨科，北京100730；2蘇州微創(chuàng)再生醫(yī)學(xué)科技有限公司215000；3上海亞朋生物技術(shù)有限公司201201；4首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院北京口腔醫(yī)學(xué)研究所，北京100050

0 引 言

近年來(lái)脫細(xì)胞基質(zhì)一直是研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。動(dòng)物源性組織如同種異體或異種骨、皮膚、肌腱、小腸黏膜等組織材料經(jīng)脫細(xì)胞處理后可得到一種生物相容性優(yōu)良、免疫原性低的支架材料[1-3]。較之大部分合成材料，其具有無(wú)法比擬的天然結(jié)構(gòu)，在去除了抗原成分的同時(shí)保留了一些對(duì)細(xì)胞增殖、分化有利的因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，是一種較為理想的生物支架材料。在組織工程研究領(lǐng)域，脫細(xì)胞基質(zhì)也表現(xiàn)出顯著的應(yīng)用價(jià)值[4-5]。

常用的組織脫細(xì)胞試劑以十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和硫代甜菜堿10（sulfobetaine 10,SB-10）等表面活性劑為主，其不僅具有清潔組織的作用，對(duì)細(xì)胞的去除效果也得到了廣泛認(rèn)可[1,6-7]。但上述表面活性劑均具有不同程度的毒性，若清洗不干凈，則殘留于脫細(xì)胞基質(zhì)中的試劑會(huì)對(duì)機(jī)體造成不同程度的毒副作用[8]。在生物醫(yī)用材料轉(zhuǎn)化為醫(yī)療器械產(chǎn)品的過(guò)程中，對(duì)于試劑殘留也提出了控制要求，應(yīng)明確試劑殘留限度值且試劑殘留不應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。目前，尚未有人系統(tǒng)研究過(guò)常用組織脫細(xì)胞試劑SDS、Triton X-100和SB-10中一種或多種試劑殘留造成細(xì)胞毒性的臨界濃度。本研究即參照國(guó)標(biāo)GB/T 16886.5中的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，探究不同脫細(xì)胞試劑單獨(dú)或混合使用對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L-929和小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1兩種細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

離子型表面活性劑SDS、非離子型表面活性劑Triton X-100（西安天正藥用輔料有限公司），兩性離子型表面活性劑SB-10（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），噻唑藍(lán)（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），α-MEM培養(yǎng)基、質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶（美國(guó)HyClone公司），青鏈霉素雙抗溶液（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物有限公司），異丙醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）（武漢賽維爾生物科技有限公司），L-929細(xì)胞、MC3T3-E1細(xì)胞（上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞中心）。

ECLIPSE Ts2倒置顯微鏡（日本Nikon公司），QP-160 CO2培養(yǎng)箱（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司），INFINITE 200 PRO多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），H-1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

L-929細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞均采用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d換液1次，細(xì)胞融合率達(dá)約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，采用質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞。

1.2.2 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-929細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105個(gè)/ml，按每孔100μl接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，分別加入不同質(zhì)量濃度的脫細(xì)胞試劑液，陰性對(duì)照組加入不含脫細(xì)胞試劑的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)液，每孔加入50μl質(zhì)量濃度為1 g/L的噻唑藍(lán)溶液共培養(yǎng)4 h；吸棄噻唑藍(lán)溶液，每孔加入100μl異丙醇，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔于570 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞毒性判定：細(xì)胞活性下降大于30%認(rèn)為有細(xì)胞毒性（定量）；可觀察到超過(guò)50%的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，即超過(guò)50%的細(xì)胞呈圓縮狀、無(wú)胞質(zhì)內(nèi)顆粒，大范圍溶解（定性）。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度脫細(xì)胞試劑對(duì)L-929細(xì)胞的細(xì)胞毒性

由圖1～3可知，3種脫細(xì)胞試劑（SDS、Triton X-100和SB-10）對(duì)L-929細(xì)胞的細(xì)胞毒性與其質(zhì)量濃度呈依賴性關(guān)系，隨著脫細(xì)胞試劑質(zhì)量濃度的增加，毒性也依次增大。當(dāng)SDS質(zhì)量濃度為1×10-3mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率為88.2%，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性；當(dāng)質(zhì)量濃度增至1×10-2mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率降為45.7%，細(xì)胞毒性反應(yīng)明顯；進(jìn)一步稀釋檢測(cè)得出SDS無(wú)細(xì)胞毒性的臨界濃度為4×10-3mg/ml，高于該值則表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性。當(dāng)Triton X-100質(zhì)量濃度為1×10-2mg/ml時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)1×10-1mg/ml時(shí)則表現(xiàn)為顯著的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步檢測(cè)得出Triton X-100無(wú)細(xì)胞毒性的臨界濃度為2×10-2mg/ml。當(dāng)SB-10質(zhì)量濃度為1×10-1mg/ml時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/ml時(shí)具有顯著的細(xì)胞毒性，進(jìn)而檢測(cè)出其臨界濃度為6×10-1mg/ml。上述3種脫細(xì)胞試劑對(duì)L-929細(xì)胞產(chǎn)生毒性的臨界濃度大小依次為SB-10＞Triton X-100＞SDS。將上述臨界濃度的3種脫細(xì)胞試劑兩兩混合或3種共混加入L-929細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，均未觀察到細(xì)胞毒性，表明這3種脫細(xì)胞試劑無(wú)毒性疊加效應(yīng)（圖4）。

圖1 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的SDS對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L-929的細(xì)胞毒性

圖2 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的Triton X-100對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L-929的細(xì)胞毒性

圖3 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的SB-10對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L-929的細(xì)胞毒性

圖4 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SDS、Triton X-100和SB-10混合對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L-929的細(xì)胞毒性

2.2 不同質(zhì)量濃度脫細(xì)胞試劑對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞毒性

由圖5～7可知，3種脫細(xì)胞試劑（SDS、Triton X-100和SB-10）對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞毒性趨勢(shì)與L-929細(xì)胞大致相同，表現(xiàn)為SDS毒性最大（臨界濃度最?。?，Triton X-100次之，SB-10最小。當(dāng)SDS質(zhì)量濃度為1×10-3mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率為94.6%；質(zhì)量濃度增至1×10-2mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率降至65.4%，且超過(guò)50%的細(xì)胞呈圓縮狀。當(dāng)Triton X-100質(zhì)量濃度為1×10-2mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率為77.2%；質(zhì)量濃度增至1×10-1mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率降為32.1%，且大部分細(xì)胞呈死亡狀態(tài)。當(dāng)SB-10質(zhì)量濃度為1 mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率為79.6%；質(zhì)量濃度增至10 mg/ml時(shí)，大部分細(xì)胞呈死亡狀態(tài)，細(xì)胞存活率為32.8%。進(jìn)一步檢測(cè)得出SDS、Triton X-100和SB-10試劑對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生毒性的臨界濃度分別為6×10-3、4×10-2、2 mg/ml，均高于對(duì)L-929細(xì)胞的臨界濃度。將上述臨界濃度的3種脫細(xì)胞試劑兩兩混合或3種共混加入MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，均未觀察到細(xì)胞毒性，表明這3種脫細(xì)胞試劑無(wú)毒性疊加效應(yīng)（圖8）。

圖5 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的SDS對(duì)小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1的細(xì)胞毒性

圖8 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SDS、Triton X-100和SB-10混合對(duì)小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1的細(xì)胞毒性

3 討論與結(jié)論

圖6 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的Triton X-100對(duì)小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1的細(xì)胞毒性

圖7 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的SB-10對(duì)小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1的細(xì)胞毒性

表面活性劑在生活中極為常見(jiàn)，其分子結(jié)構(gòu)一端為極性親水基團(tuán)，另一端為非極性疏水基團(tuán)。根據(jù)親水性頭部的帶電性質(zhì)，表面活性劑可分為離子型、非離子型和兩性離子型。離子型表面活性劑又因所帶電荷不同，分為陽(yáng)離子型和陰離子型。表面活性劑的獨(dú)特理化性質(zhì)使其具有洗滌、分散、乳化、防腐、殺菌等作用，在民用、工業(yè)以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛[9]。常見(jiàn)的表面活性劑有季銨化物、硬脂酸、SDS、甜菜堿、聚山梨酯和Triton X-100等。

在組織工程材料研究領(lǐng)域，脫細(xì)胞組織/器官因具有天然組織/器官的結(jié)構(gòu)、較好的生物相容性、能為細(xì)胞和組織生長(zhǎng)提供良好的生物學(xué)環(huán)境而被廣泛應(yīng)用。表面活性劑則是最常用的脫細(xì)胞試劑，其可溶解細(xì)胞膜，使DNA與蛋白質(zhì)分離，有效去除組織中的細(xì)胞成分，降低免疫原性，故被廣泛應(yīng)用于同種或異種組織/器官的脫細(xì)胞過(guò)程[10]。但表面活性劑廣泛應(yīng)用的同時(shí)也帶來(lái)了另一個(gè)問(wèn)題：試劑殘留。筆者注意到研究者在使用表面活性劑制備脫細(xì)胞支架后，通常使用大量的水或PBS長(zhǎng)時(shí)間清洗脫細(xì)胞支架，以求降低試劑殘留量。但卻很少有研究討論常用脫細(xì)胞試劑殘留量的限度值應(yīng)為多少，而盲目清洗會(huì)造成時(shí)間和資源的浪費(fèi)，甚至對(duì)脫細(xì)胞支架的性能造成不利影響[1,11]。因此，研究確定表面活性劑的安全濃度值，制定其殘留量控制標(biāo)準(zhǔn)顯得尤其重要。本研究即選擇常用的具有代表性的離子型表面活性劑SDS、非離子型表面活性劑Triton X-100以及兩性離子型表面活性劑SB-10，參照國(guó)標(biāo)GB/T 16886.5細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，以L-929細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞為模型，探究了上述3種表面活性劑單獨(dú)或混合使用的細(xì)胞毒性臨界濃度。

對(duì)于L-929細(xì)胞，SDS、Triton X-100和SB-10的細(xì)胞毒性臨界濃度分別為4×10-3、2×10-2和6×10-1mg/ml，毒性大小依次為SDS＞Triton X-100＞SB-10。這與表面活性劑本身的作用強(qiáng)弱有一定關(guān)聯(lián)，SDS是一種比較強(qiáng)力的表面活性劑，不僅可溶解細(xì)胞膜，還可能打破蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的相互作用，致使蛋白質(zhì)變性[12]，故SDS表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。Triton X-100相對(duì)于SDS屬于較溫和的表面活性劑，其細(xì)胞毒性臨界濃度略低于SDS。兩性離子型表面活性劑SB-10最為溫和，其細(xì)胞毒性臨界濃度最大，分別為SDS和Triton X-100臨界濃度的150倍和30倍，表明其毒性最小。MC3T3-E1細(xì)胞呈現(xiàn)出與L-929細(xì)胞相似的趨勢(shì)，SDS、Triton X-100以及SB-10的臨界濃度分別為6×10-3、4×10-2和2 mg/ml。這與以往報(bào)道的其他離子型和非離子型表面活性劑細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)基本一致，即毒性大小趨勢(shì)為陽(yáng)離子型表面活性劑＞陰離子型表面活性劑＞非離子型表面活性劑[13-14]。本研究結(jié)果顯示，3種表面活性劑（SDS、Triton X-100和SB-10）對(duì)L-929、MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生毒性的臨界濃度不同，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的臨界濃度大于對(duì)L-929細(xì)胞，提示表面活性劑對(duì)不同細(xì)胞的毒性作用/濃度可能存在差異。將上述臨界濃度的3種試劑兩兩混合或3種共混加入L-929、MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)后，均未觀察到細(xì)胞毒性，表明這3種試劑無(wú)毒性疊加效應(yīng)。

雖然直接采用不同濃度的試劑進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)不能完全替代脫細(xì)胞支架試劑殘留的真實(shí)情況，但對(duì)于脫細(xì)胞支架而言，組織中的試劑殘留量應(yīng)低于組織浸提、洗脫、消解后的試劑殘留量。本研究結(jié)果可為研究人員采用上述表面活性劑制備脫細(xì)胞支架提供一些安全性證據(jù)，以便在了解臨界濃度后采用多種試劑清洗工序高效清洗組織，使試劑殘留量低于臨界值，確保脫細(xì)胞支架的生物安全性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突