汪?；?閆國良 樓丹飛 鄭天虹

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071）

膿毒癥是急危重癥醫(yī)學(xué)尚待攻克的重要臨床難題之一。急性肺損傷（ALI）作為膿毒癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其治療亦是攻克膿毒癥的難點(diǎn)［1-2］。細(xì)胞程序性壞死又稱壞死性凋亡，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞程序性死亡方式。研究表明，壞死性凋亡可直接或間接加重炎癥反應(yīng)，其信號(hào)的改變與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-5］，抑制壞死性凋亡可有效減輕ALI并提高患者存活率［6-7］，且壞死性凋亡調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)可作為膿毒癥患者早期預(yù)后的生物標(biāo)志物［8］。近年來國內(nèi)學(xué)者已逐步開展程序性壞死對(duì)膿毒癥炎癥反應(yīng)的研究，中醫(yī)藥在調(diào)控程序性壞死方面有著廣泛的應(yīng)用前景。本課題組自擬中藥復(fù)方抗炎合劑，已通過大量基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)證實(shí)可有效減輕膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)，改善臨床癥狀［9-13］。綜上，本研究擬通過制備膿毒癥致ALI大鼠模型，探討膿毒癥致ALI發(fā)病過程中炎癥因子及組織細(xì)胞程序性壞死的變化，以及中藥抗炎合劑對(duì)其的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量200～220 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：20170005021765，飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)許可證號(hào)SYXK（滬）2014-0019，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。

1.2 試藥與儀器 抗炎合劑，組方：大黃15 g，黃芩12 g，厚樸12 g，敗醬草 30 g，黃連15 g，由上海市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，所有中藥飲片均符合2010年版《中國藥典》規(guī)定要求，并由制劑中心進(jìn)行炮制加工，制備成含生藥1.0 g/mL的棕色透明液體，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。Necrostatin-1購自麥克林公司，批號(hào)C109457712。Tunel試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2020001。ELISA試劑盒購自上海富勒科技有限公司，批號(hào)201911。PCNA試劑盒購自abcam公司，批號(hào)2019010。離心機(jī)：ThermoFRESCO17，石蠟切片機(jī)：Leica RM2235，水浴鍋：Lecia HI1210，水平干式烘干儀：Leica HI1220，顯微鏡：OLYMPUS BX51。

1.3 分組與造模 用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組：假手術(shù)組、模型組、中藥組、壞死性凋亡抑制劑組（Nec-1組），每組10只。禁食不禁水12 h，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥致 ALI大鼠模型［14］：以10%水合氯醛麻醉大鼠后，中下腹正中做一約1.0 cm長的切口，找到盲腸，在其根部2/3處進(jìn)行結(jié)扎，用5 mL注射器針頭穿通2～3次，避免損傷腸壁血管，輕擠出少量腸內(nèi)容物，回納盲腸于腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)畢皮下注射0.9%NaCl抗休克。假手術(shù)組：大鼠經(jīng)麻醉后開腹，輕輕翻動(dòng)腸道后關(guān)腹。

1.4 干預(yù)方法 造模前3 d及造模后中藥組予抗炎合劑灌胃（14 g/kg），Nec-1組予Necrostain-1腹腔注射（0.6 mg/kg），每日1次。正常組及模型組同時(shí)灌服及注射等量生理鹽水。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 各組大鼠術(shù)后24 h麻醉并腹主動(dòng)脈采血后行標(biāo)本采集及檢測(cè)。1）血液白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）指標(biāo)的檢測(cè)：血液標(biāo)本3 000 r/min4℃離心10 min，然后吸取血清。按照ELISA試劑盒（購自上海富勒生物科技有限公司）說明書的方法進(jìn)行動(dòng)脈血IL-1β、IL-6、TNF-α指標(biāo)的檢測(cè)。2）肺組織HE染色：沿大鼠左右肋軟骨迅速打開胸腔，取出左右肺，用生理鹽水沖洗表面，冰上切取肺組織，用4%多聚甲醛中固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋、切片，片厚分別為3 μm、5 μm。3 μm厚的石蠟組織片用于HE染色，觀察肺組織的病理變化。3）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)凋亡細(xì)胞：取5 μm厚的石蠟組織片用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL），對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞，每張切片選取5個(gè)視野，按照每張切片至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)以百分?jǐn)?shù)表示（%）。4）增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）測(cè)定：取5 μm厚的石蠟組織片染色后細(xì)胞核內(nèi)可見大小不等的黃色或棕色黃色顆粒為PCNA陽性。染色完成后，應(yīng)用Im?age Pro Plus圖像分析軟件測(cè)算其積分光密度值（IOD值），并隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行測(cè)定，所得IOD值的平均值為最終值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 假手術(shù)組大鼠進(jìn)食飲水、排泄、呼吸狀況、活動(dòng)量及精神狀態(tài)無明顯異常；模型組大鼠術(shù)后不欲進(jìn)食，腹部膨隆，無排便，活動(dòng)量減少，呼吸急促，眼鼻口處分泌物多；中藥組與Nec-1組大鼠術(shù)后精神狀況、活動(dòng)量好于模型組，眼鼻口處分泌物少于模型組。

2.2 各組大鼠肺組織病理染色 假手術(shù)肺組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔清晰，間質(zhì)無水腫、炎癥等病理改變；模型組可見肺泡明顯減少，肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，局部可見實(shí)變，肺間質(zhì)可見水腫；中藥組及Nec-1組與模型組相比，炎性細(xì)胞浸潤相對(duì)較少，肺實(shí)變較輕，間質(zhì)水腫較少。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 見表1。模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量較假手術(shù)組明顯增高（P<0.01），而中藥組和Nec-1組較模型組降低（P<0.01），而其中Nec-1組較抗炎合劑組降低得更為顯著（P<0.01）。

表1 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與假手術(shù)組比較，??P<0.01，與模型組比較，△△P<0.01，與抗炎合劑組比較，☆☆P<0.01。下同。

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2.4 各組大鼠肺組織凋亡指標(biāo)比較 見表2，圖2～圖3。圖2中假手術(shù)組內(nèi)僅見個(gè)別凋亡細(xì)胞，模型組內(nèi)可見大量棕黃色的凋亡細(xì)胞，而中藥組及Nec-1凋亡細(xì)胞較模型組明顯減少。圖3中模型組PCNA陽性染色較中藥組及Nec-1組明顯增強(qiáng)。模型組大鼠肺組織Tunel染色細(xì)胞凋亡百分比及PCNA水平較假手術(shù)組明顯增高（P<0.01），中藥組和Nec-1組較模型組降低（P<0.01），且兩組之間無顯著差異（P>0.05）。

表2 各組大鼠肺組織中Tunel染色細(xì)胞凋亡指數(shù)及PCNA水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織中Tunel染色細(xì)胞凋亡指數(shù)及PCNA水平比較（±s）

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圖2 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡（Tunel染色，200倍）

圖3 各組大鼠肺組織中PCNA的陽性表達(dá)（免疫組化，200倍）

3 討 論

細(xì)胞程序性壞死是由受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）、混合系列蛋白激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（MLKL）介導(dǎo)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死，其參與了許多炎癥性疾?。?5-16］。有研究顯示，高脂飲食可通過TLR4介導(dǎo)的程序性壞死和炎癥加重大鼠急性胰腺炎［17］。另外，條件性敲除TGF-βRⅡ/Smad2信號(hào)可通過減輕細(xì)胞程序性壞死、凋亡和炎癥保護(hù)急性腎損傷［18］。近年來，程序性壞死抑制劑被發(fā)現(xiàn)可作為一項(xiàng)新的治療靶點(diǎn)在炎癥介導(dǎo)疾病中發(fā)揮重要作用［19］。膿毒癥引起的ALI屬于中醫(yī)學(xué)“喘證”“暴喘”“喘脫”范疇，根據(jù)“肺與大腸相表里”的中醫(yī)經(jīng)典理論，肺熱葉焦、腸道津虧，毒邪聚集腸中，久則熱毒互結(jié)，內(nèi)陷營血，從而損傷臟腑脈絡(luò)為其病機(jī)?；诖?，筆者采用清熱解毒、通腑活血之法，創(chuàng)立通腑中藥復(fù)方抗炎合劑，方中大黃為君，瀉下攻積、清熱瀉火、活血祛瘀，黃芩、黃連為臣，清熱燥濕、瀉火解毒，厚樸、敗醬草為佐，行氣平喘、消癰排膿，全方共奏清熱通腑、活血排毒之功效。在本實(shí)驗(yàn)中，膿毒癥ALI模型組大鼠炎癥指標(biāo)及凋亡指標(biāo)較假手術(shù)組明顯升高，說明程序性壞死在膿毒癥發(fā)展過程中扮演十分重要的角色，且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而中藥復(fù)方抗炎合劑對(duì)膿毒癥ALI大鼠肺組織細(xì)胞程序性壞死及炎癥反應(yīng)均具有明顯的改善作用，說明該中藥復(fù)方可通過減輕組織器官的程序性壞死而起到減輕膿毒癥炎癥反應(yīng)的作用。但其對(duì)程序性壞死與炎癥反應(yīng)之間的具體信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究中尚未明確，需更進(jìn)一步的探索。

綜上所述，中藥在抑制程序性壞死、減輕膿毒癥器官功能損傷方面具有十分廣闊的研究前景，開辟了膿毒癥治療的新思路，值得我們進(jìn)一步去深入研究。