張 勇 高桂花

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826)

α-葡萄糖苷酶能催化α-1,4-糖苷鍵水解，使小腸內(nèi)麥芽糖、蔗糖等寡糖水解。通過(guò)抑制該酶的活性，可減緩葡萄糖的生成及吸收，調(diào)整血糖水平。青錢(qián)茶是青錢(qián)柳葉、黃芪、山藥及綠茶制成的泡茶飲，具有降糖作用。其降糖機(jī)制可能為競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷酶，故評(píng)價(jià)其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性具有十分重要的意義。

目前關(guān)于α-葡萄糖苷酶抑制劑體外評(píng)價(jià)方法主要采用紫外分光光度法[1-2]。但當(dāng)抑制劑本身在測(cè)定波長(zhǎng)下具有紫外吸收時(shí)，會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)法，將干擾物質(zhì)與產(chǎn)物分離后[3-4]，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，從而達(dá)到精準(zhǔn)評(píng)價(jià)α-葡萄糖苷酶抑制劑活性的目的?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；BP211D電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(湘儀儀器廠)。

1.2 試藥

α-葡萄糖苷酶(北京百靈威科技有限公司)；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(北京百靈威科技有限公司，純度98%)；對(duì)硝基酚(PNP)(北京百靈威科技有限公司，純度99%)；米格列醇(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，純度≥98%)；乙腈(色譜純，Burdick & Jackson)；青錢(qián)茶(江西省修水神茶實(shí)業(yè)有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試液的制備

1)0.1mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)。精密稱(chēng)取0.68g磷酸二氫鉀和0.705g磷酸氫二鈉置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2)2.5mmol·L-1PNPG溶液。精密稱(chēng)取PNPG 18.81mg，置25ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

3)1U·ml-1α-葡萄糖苷酶溶液。精密稱(chēng)取α-葡萄糖苷酶100U，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。于冰箱中冷藏保存。

4)0.2mol·L-1反應(yīng)終止液。精密稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉0.216g，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

5)5mmol·L-1PNP對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取PNP 17.42mg，置25ml容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液溶解至刻度，搖勻。

2.2 供試品溶液的制備

1)青錢(qián)茶提取物。取青錢(qián)茶3.0g，加沸水250ml，室溫浸泡15min，濾過(guò)，再同法浸泡兩次，濾液濃縮，蒸干，即得。

2)青錢(qián)茶供試品溶液。取青錢(qián)茶水提取物適量，溶于磷酸鹽緩沖液中，得青錢(qián)茶供試品溶液。

3)米格列醇供試品溶液。取米格列醇適量，溶于磷酸鹽緩沖液中，得米格列醇供試品溶液。

2.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)

α-葡萄糖苷酶抑制劑體外活性篩選是以PNPG作為底物，PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下可分解產(chǎn)生PNP，以PNP作為檢測(cè)物評(píng)價(jià)α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性[5-8]，按照表1取PBS、α-糖苷酶試液，米格列醇供試品溶液及青錢(qián)茶供試品溶液，混勻，37℃孵育10min。再分別加入PNPG溶液，混勻，37℃反應(yīng)90min后，加反應(yīng)終止液混勻，終止反應(yīng)，制得空白對(duì)照溶液、陽(yáng)性對(duì)照溶液及樣品溶液。采用高效液相色譜法測(cè)定生成的PNP，按下式計(jì)算抑制率。

表1 反應(yīng)液體積/μl

2.4 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18(2)柱(200×4.6mm，5.0μm)；流動(dòng)相：0.3%乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序?yàn)?～25min，10%～90% B；25～27min，90%～10% B；27～35min，10% B；流速1ml·min-1；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為315nm；進(jìn)樣量10μl。

2.5 含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取樣品溶液、陽(yáng)性對(duì)照溶液及空白對(duì)照溶液各10μl，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，空白對(duì)照、PNPG及雜質(zhì)均不干擾PNP的測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖1。

注：Ⅰ-樣品溶液；Ⅱ-陽(yáng)性對(duì)照溶液；Ⅲ-空白對(duì)照溶液

2.5.2線性關(guān)系考察 取PNP溶液，逐級(jí)稀釋制成17.42、34.84、69.68、139.36、348.4μg·ml-1的溶液。經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣10μl。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。結(jié)果PNP在17.42～348.4μg·ml-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為Y=5299920X+593618(r=0.9997)。

2.5.3精密度試驗(yàn) 取PNP標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果，PNP峰面積RSD為0.52%，表明儀器精密度良好。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份青錢(qián)茶樣品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果PNP峰面積RSD為0.6%，表明對(duì)照品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5檢測(cè)限和定量限 取PNP對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)苽鋵?duì)照品溶液進(jìn)樣10μl，以S/N=3∶1時(shí)PNP的質(zhì)量為檢測(cè)限，S/N=10∶1時(shí)PNP的質(zhì)量為定量限。結(jié)果PNP的檢測(cè)限為0.1ng，定量限為0.2ng。

2.5.6加樣回收率及重復(fù)性試驗(yàn) 取青錢(qián)茶提取物50.12mg，置10ml容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，得5.012mg·ml-1的青錢(qián)茶提取物溶液。分別取青錢(qián)茶提取物溶液25、25、25μl，PNP溶液11、14、17μl，PBS溶液14、11、8μl混勻作為供試品溶液，按照“2.3”方法制備抑制樣品溶液，每個(gè)水平平行3份。按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定PNP濃度，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2，平均回收率為98.8%，RSD為1.5%。

取上述青錢(qián)茶提取物溶液25μl、PBS溶液25μl混合作為重復(fù)性供試品溶液，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備抑制樣品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定PNP濃度，計(jì)算抑制率。青錢(qián)茶提取物的抑制率重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為1.9%，表明方法重復(fù)性良好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.6 樣品測(cè)定

精密稱(chēng)取米格列醇及青錢(qián)茶提取物，按“2.3”項(xiàng)下方法制備抑制樣品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明青錢(qián)茶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用，且具有濃度依賴(lài)性。見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜法測(cè)定PNP的優(yōu)勢(shì)在于經(jīng)色譜柱分離后，中藥提取物中組分不再干擾PNP的測(cè)定。鑒于青錢(qián)茶提取物中成分較多，采用梯度洗脫方式，以確保PNP測(cè)定不受干擾。分別考察了甲醇與乙腈作為有機(jī)相時(shí)的分離情況，在保留時(shí)間相近的情況下，使用乙腈時(shí)分離效果更好。添加乙酸能夠改善峰形，減小拖尾。

3.2 酶促反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

按照2.3確定的條件，以青錢(qián)茶提取物為抑制劑，分別在30、50、70、90、110、130min加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物PNP的變化。結(jié)果在90min時(shí)PNP的產(chǎn)量已經(jīng)足夠，適宜高效液相色譜儀測(cè)定，確定反應(yīng)時(shí)間為90min。

3.3 青錢(qián)茶α糖苷酶抑制活性

米格列醇是一種高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，對(duì)各種α-葡萄糖苷酶均有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是對(duì)蔗糖酶和葡萄糖淀粉酶有更強(qiáng)的抑制作用。青錢(qián)柳葉其主要功能性成分為黃酮、多糖及三萜等類(lèi)物質(zhì)[9-12]，由青錢(qián)茶α-糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，青錢(qián)茶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用具有濃度依賴(lài)性，等量10mg·ml-1的青錢(qián)茶提取物與2.5mg·ml-1的米格列醇的體外抑制作用相當(dāng)，其IC50為1.7mg·ml-1。

綜上所述，本文采用HPLC法成功將干擾物質(zhì)與PNP分離，并準(zhǔn)確測(cè)定PNP的含量，所建立的方法定量準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，能夠用于精準(zhǔn)評(píng)價(jià)青錢(qián)茶對(duì)α-糖苷酶的抑制活性。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青錢(qián)茶具有顯著的抑制α-糖苷酶活性的能力，其抑制作用具有濃度依賴(lài)性，這為青錢(qián)茶進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供了一定的依據(jù)。