劉奎昊，李焱，李超，趙君，孟凡亮，劉思當(dāng)*，李寧

山東省某規(guī)模化豬場(chǎng)豬胸膜肺炎綜合診斷

劉奎昊1?，李焱1?，李超2，趙君1，孟凡亮1，劉思當(dāng)1*，李寧1

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)/山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018；2.山東省夏津縣行政審批服務(wù)局，山東 夏津）

本研究對(duì)泰安某規(guī)?；i場(chǎng)育肥豬的病死豬進(jìn)行了病理剖檢觀察、病理組織學(xué)檢查和病原檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病豬心包擴(kuò)張，腔內(nèi)充滿(mǎn)漿液纖維素性滲出物，肺胸膜表面有纖維素滲出，肺膈葉暗紅色實(shí)變，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肺呈卡他性纖維素性出血性肺炎病變，肺組織內(nèi)可見(jiàn)藍(lán)染球桿菌。PCR檢測(cè)僅豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌呈陽(yáng)性，通過(guò)細(xì)菌分離和16S rDNA測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)該菌為豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌，遺傳進(jìn)化分析顯示其與目前我國(guó)豬場(chǎng)中流行的豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌株的遺傳關(guān)系較近，未見(jiàn)明顯變異。

豬傳染性胸膜肺炎；放線(xiàn)桿菌；分離鑒定；遺傳變異

豬傳染性胸膜肺炎（porcine infectious pleuro-pneumonia）是由胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌（APP）引起的一種高度傳染性呼吸道疾病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。各年齡段、性別的豬對(duì)APP均易感，但以3月齡左右的育肥豬發(fā)病率較高。豬感染APP后主要表現(xiàn)為高熱、呼吸困難、咳嗽、拒食和突然死亡。病死豬剖檢病變主要局限于胸腔，可見(jiàn)特征性的纖維素性、壞死性和出血性肺炎以及纖維素性胸膜炎[1]。

我國(guó)1987年首次發(fā)現(xiàn)APP。該菌血清型眾多，在我國(guó)流行較為復(fù)雜。2018年，新疆地區(qū)暴發(fā)了以血清5型為主的豬傳染性胸膜肺炎[2]。近期，河南省洛陽(yáng)市出現(xiàn)以血清5型為主的豬傳染性胸膜肺炎[3]，皖西地區(qū)某規(guī)?；i場(chǎng)分離的菌株則是血清7型[4]。整體上，我國(guó)主要以血清1、2、3、5和7型流行較為普遍[5]。

近期，山東省某規(guī)模化豬場(chǎng)暴發(fā)呼吸道疾病，病死率較高。為確診該病，對(duì)該豬場(chǎng)發(fā)病豬進(jìn)行了常規(guī)病理剖檢、常見(jiàn)病原的PCR檢測(cè)，以及細(xì)菌分離鑒定和測(cè)序分析，最終鑒定引起該豬場(chǎng)疫情的病原為APP。本次診斷對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的診斷和防治有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試驗(yàn)材料 核酸提取試劑盒（Easypure Viral DNA/RNA Kit）、克隆試劑盒（pEASY-T1 Simlie）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒（Biospin Gel Extraction Kit）購(gòu)自杭州博日科技有限公司；瓊脂糖粉購(gòu)自Sigma公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、血瓊脂培養(yǎng)基、普通酶、DL 2 000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 發(fā)病情況 2019年3月，山東省某規(guī)?；i場(chǎng)90 kg左右的育肥豬出現(xiàn)精神沉郁、體溫上升、咳嗽、氣喘、呼吸困難和耳朵發(fā)紫等癥狀，發(fā)病嚴(yán)重豬出現(xiàn)死亡。該養(yǎng)殖場(chǎng)共有商品肉豬2 000頭，發(fā)病率為約10 %，83頭發(fā)病嚴(yán)重的豬死亡。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢及組織病理學(xué)檢測(cè) 對(duì)病死豬進(jìn)行病理剖檢，觀察記錄病豬各臟器病理變化。采取病豬的肺、脾和腎等組織樣品，于10 % 福爾馬林溶液固定，按照常規(guī)方法制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后鏡檢組織病理學(xué)變化。

1.2.2 細(xì)菌分離鑒定 使用高溫滅菌接種環(huán)，對(duì)病豬肺組織進(jìn)行無(wú)菌取樣；樣品接種于含有NAD的血瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況；挑取單菌落置于載玻片上，用50ml無(wú)菌PBS均勻涂抹，革蘭染色后鏡檢觀察細(xì)菌染色及形態(tài)特征。

1.2.3 PCR檢測(cè) （1）將采集的病豬組織樣品剪碎后加入適量滅菌PBS研磨勻漿，置于 ? 80 ℃ 反復(fù)凍融3次后，4 ℃ 9 000 r/min離心3 min，取上清提取核酸并將其作為模板對(duì)臨床常見(jiàn)病原進(jìn)行PCR檢測(cè)，包括豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respire-tory syndrome virus，PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（porcine pseudorabies virus，PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）、副豬嗜血桿菌（Hps）和APP，以及APP的毒素基因。細(xì)菌16S rDNA通用引物為27F/1492R。以上引物均為本實(shí)驗(yàn)室保存，具體序列見(jiàn)表1。（2）將提取的核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用檢測(cè)引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系25 μl：2×Plus Master MixⅡ（Dye Plus）12.5ml，上下游引物各1ml，模板3 μl，ddH2O 7.5ml。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52～57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將得到目的片段進(jìn)行T-A克隆，陽(yáng)性菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。從GenBank中下載7株APP序列（KR071801、AB635380.1、AF033058.1、AF033060.1、KX579946、M75074.1和NR-044752.2），2株沙門(mén)氏菌（）序列（KY776577和MT500568.1），通過(guò)MEGA6軟件中的Maximum Likehood tree方法進(jìn)行該分離菌株的遺傳進(jìn)化分析，同時(shí)使用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理及病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果 剖檢病死豬可見(jiàn)肺出血，肺表面有纖維素滲出，肺和胸膜壁層粘連。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：肺泡腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞和漿液纖維素滲出；肺泡壁增厚，間質(zhì)有紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；支氣管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的黏膜上皮細(xì)胞，肺泡壁和肺泡腔內(nèi)有藍(lán)染球桿狀細(xì)菌，并見(jiàn)充血出血和纖維素滲出。結(jié)果表明，該豬場(chǎng)豬群發(fā)病可能由細(xì)菌引起。

2.2 分離的細(xì)菌 將病死豬肺組織樣品接種含有NAD的血瓊脂培養(yǎng)基24 h后，可見(jiàn)直徑約1 mm左右表面光滑、圓形、邊緣整齊、針尖大小的菌落，在菌落周邊出現(xiàn)溶血環(huán)現(xiàn)象，在油鏡下可見(jiàn)革蘭氏紅染的球桿菌。初步推斷，該分離菌為APP。

表1 試驗(yàn)中所用檢測(cè)引物信息

圖1 常見(jiàn)病原及毒力基因ApxIV的PCR檢測(cè)結(jié)果

A. 常見(jiàn)病原檢測(cè)；B. 毒力基因檢測(cè)；M. DNA Marker；+. 陽(yáng)性對(duì)照；–. 陰性對(duì)照；1. 檢測(cè)樣品。

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果 以發(fā)病豬的肺組織樣品為模板進(jìn)行常見(jiàn)病原的PCR檢測(cè)。在該發(fā)病豬場(chǎng)32份樣品中，共有28份檢測(cè)到345 bp的目的條帶，陽(yáng)性率為87.5 %，CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2和Hps均為陰性，僅APP為陽(yáng)性（圖1-A），APP的毒力基因也為陽(yáng)性（圖1-B），從而證實(shí)該菌為APP。

2.4 分離菌株遺傳進(jìn)化分析 進(jìn)一步將APP分離株（SD20191）進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序，通過(guò)MEGA進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，該分離菌與其他豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌分離株（包括KR071801、AB635380.、AF033058.1和AF033060.1）在同一個(gè)分支（圖2），核苷酸同源性為100 %（圖3）。

圖2 分離菌株的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

3 討論

豬傳染性胸膜肺炎是由APP引起的一種急性傳染性呼吸道疾病，其對(duì)豬有高度的宿主特異性，主要經(jīng)空氣和接觸傳播。APP專(zhuān)性寄生于宿主呼吸道，急性感染時(shí)可存在于肺部、血液和鼻液中[6]。該病在3～5月和9～11月多發(fā)，有明顯的季節(jié)性流行規(guī)律，且易造成保育豬和育肥豬生長(zhǎng)障礙或死亡[7]。

在本研究中，發(fā)病豬場(chǎng)90 kg左右的育肥豬出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽癥狀，發(fā)病率約為40 %。首先通過(guò)病死豬病理剖檢，觀察到肺表面有大量纖維素性滲出物，并與胸膜粘連，通過(guò)組織病理學(xué)檢測(cè)，可見(jiàn)肺組織有明顯的出血性卡他性炎癥，而且在肺泡腔及其間質(zhì)內(nèi)有大量藍(lán)染球桿菌，初步懷疑該病為豬傳染性胸膜肺炎。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)PCR檢測(cè)臨床常見(jiàn)病原，僅檢測(cè)出APP，排除了其他病原的感染。APP的外毒素（Apx）在細(xì)菌感染和致病過(guò)程中具有重要作用，其包括4個(gè)亞型：ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV[8]。其中，ApxIV能在感染豬體內(nèi)產(chǎn)生并且具有種屬特異性。該毒素基因常被作為臨床診斷APP的特異性基因。通過(guò)PCR檢測(cè)，在病死豬肺組織樣品中檢測(cè)到，進(jìn)一步表明病死豬感染了APP。

然后，通過(guò)細(xì)菌分離鑒定和16S rDNA測(cè)序等一系列實(shí)驗(yàn)室方法，進(jìn)一步確定了引起該豬場(chǎng)疫情的病原為APP。由于APP的血清型眾多，該分離菌株的血清型尚未確定。遺傳進(jìn)化分析顯示，本研究中獲得的APP分離株與當(dāng)前我國(guó)豬場(chǎng)主要的流行菌株相一致，如KR071801是2015年在我國(guó)江西省分離的[9]。

本研究對(duì)該豬場(chǎng)暴發(fā)的豬傳染性胸膜肺炎進(jìn)行了較為系統(tǒng)的診斷，可為該病的診斷和防控提供一定幫助。

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?共同第一作者

（2021–01–25）

S858.28

A

1007-1733（2021）05-0005-03