王東江， 郭 建

（上海市東方醫(yī)院南院檢驗(yàn)科，上海 200120）

可引起感染的隱球菌主要包括新生隱球菌和格特隱球菌，常見的感染部位是中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺部和皮膚。隱球菌主要引起免疫抑制患者的感染，其發(fā)病率約為6～10%，獲得性免疫缺陷綜合征患者隱球菌病的發(fā)病率更可高達(dá)30%[1]。在免疫功能正常的人群中，隱球菌的感染率則很低，僅有十萬分之一感染的可能，早期診斷對預(yù)后至關(guān)重要[2]。耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致臨床抗隱球菌感染治療失敗的重要原因之一。近年來，隱球菌屬對氟康唑的最小抑菌濃度明顯升高[3]，及時(shí)、規(guī)范的真菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果對精準(zhǔn)治療具有重要意義。發(fā)病隱匿、病死率高是隱球菌性腦膜腦炎的重要特征[4]。本研究對1例免疫功能正常的中年男性隱球菌感染病例的診斷與治療過程進(jìn)行分析，為臨床合理選擇診斷項(xiàng)目，提高檢驗(yàn)路徑的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 病例資料

患者，男，46歲。10年前曾患胃炎，平素體健，無藥物過敏和慢性病史，無傳染病及手術(shù)外傷史，否認(rèn)有鴿子接觸史。1周前無明顯誘因開始出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咳白色黏痰，伴有胃反酸、頭痛、畏寒。2019年7月23日來上海市東方醫(yī)院南院急診內(nèi)科就診，體溫37.5 ℃，予以左氧氟沙星、頭孢美唑抗感染治療，奧西康抑酸護(hù)胃等對癥支持治療。治療5 d后癥狀未見明顯好轉(zhuǎn)，仍有反復(fù)發(fā)熱，且近2 d出現(xiàn)腹瀉。7月30日因“發(fā)熱伴咳嗽、咳痰1周”入院。入院影像學(xué)檢查示：腦部未見明顯可疑感染癥狀，左肺上葉小結(jié)節(jié)，雙側(cè)胸膜局部小結(jié)節(jié)樣增厚，雙肺少許纖維灶，見圖1。

圖1 腦部和胸部影像學(xué)檢查結(jié)果

患者入院后完善相關(guān)檢查，呼吸內(nèi)科先后予以莫西沙星0.4 g qd、鹽酸萬古霉素1 g q12 h靜滴進(jìn)行抗感染治療。8月3日，患者反復(fù)發(fā)熱伴頭痛，腋窩淋巴結(jié)增大，雙側(cè)腹股淋巴結(jié)增大?？紤]患者發(fā)熱與病毒感染有關(guān)，給予比阿培南、地塞米松及更昔洛韋繼續(xù)抗感染、抗病毒對癥支持治療，同時(shí)給予甘露醇降顱壓。

2019年8年5日，考慮顱內(nèi)感染轉(zhuǎn)入神經(jīng)內(nèi)科，給予更昔洛韋、頭孢曲松鈉抗感染治療，脫水利尿。8月7日出現(xiàn)頸項(xiàng)強(qiáng)直、四肢抽搐，突發(fā)頸項(xiàng)強(qiáng)直，腦膜刺激征陽性，腦電圖中度彌漫性異常。行腰椎穿刺，腦脊液壓力35.0 cm H2O，腦脊液墨汁染色檢查危急值報(bào)告提示“查見大量有莢膜的酵母樣真菌孢子，疑似隱球菌感染”，轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護(hù)病房后調(diào)整用藥方案，給予氟康唑抗真菌感染治療。患者伴有發(fā)熱，考慮真菌血癥，采集雙側(cè)雙瓶血培養(yǎng)送檢，同時(shí)采集腦脊液進(jìn)行細(xì)菌和真菌培養(yǎng)。

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行真菌培養(yǎng)鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果提示棘白菌素耐藥，氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和兩性霉素B根據(jù)流行病學(xué)折點(diǎn)（epidemiological cutoff value，ECV）判讀為敏感[5]。邀華山醫(yī)院感染科專家會(huì)診后，應(yīng)家屬要求轉(zhuǎn)入華山醫(yī)院感染科住院治療。治療方案為兩性霉素B用藥至累積2.5 g，調(diào)整方案為氟康唑600 mg qd聯(lián)合5-氟胞嘧啶1.5 g qd口服。對患者隨訪6個(gè)月，患者用藥期間無明顯不適，腰椎穿刺、血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)未見明顯異常，預(yù)后良好。

2 實(shí)驗(yàn)室檢查

8月3日，巨細(xì)胞病毒抗體、單純皰疹I(lǐng)型IgG抗體檢測均為陽性。腦脊液用細(xì)胞離心機(jī)771×g離心20 min后制片，烤干玻片后進(jìn)行革蘭染色。腦脊液771×g離心20 min，棄上清，取沉淀進(jìn)行真菌熒光染色和墨汁染色。同時(shí)，對腦脊液上清液進(jìn)行隱球菌莢膜抗原快速檢測。將5 mL腦脊液注入需氧血培養(yǎng)瓶內(nèi)增菌，同時(shí)采集雙側(cè)雙瓶血培養(yǎng)瓶置Versa TREK240全自動(dòng)血培養(yǎng)儀（美國賽默飛世爾公司）培養(yǎng)。對血培養(yǎng)和腦脊液培養(yǎng)分離出的新生隱球菌進(jìn)行快速質(zhì)譜鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)。

腦脊液常規(guī)檢查結(jié)果為無色、透明，白細(xì)胞547×106/L，中性粒細(xì)胞42%，單核細(xì)胞5%，淋巴細(xì)胞53%，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)1 000×106/L，潘氏試驗(yàn)結(jié)果為陽性。腦脊液生化檢測結(jié)果顯示葡萄糖＜1.10 mmol/L，氯112 mmol/L，總蛋白1 240 mg/L。隱球菌莢膜抗原快速檢測陽性。取1 mL腦脊液通過細(xì)胞離心機(jī)制片后行革蘭染色，查見大量酵母樣真菌孢子。真菌熒光染色找到真菌孢子，隱球菌墨汁染色查見大量有莢膜的酵母樣真菌孢子，疑似隱球菌。見圖2。

圖2 新生隱球菌墨汁染色、革蘭染色、相差顯微鏡和熒光染色結(jié)果

腦脊液和血培養(yǎng)瓶分別培養(yǎng)24～48 h，血培養(yǎng)儀器提示陽性，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板、巧克力平板、麥康凱平板和沙保弱平板（美國賽默飛世爾公司）。35 ℃培養(yǎng)24 h后，采用Autof ms1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（鄭州安圖公司）進(jìn)行菌株鑒定，腹腔積液3次檢測結(jié)果均為新生隱球菌（Cryptococcus neoformans），鑒定分值均>9.50。

參照2017年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）要求進(jìn)行隱球菌藥物敏感性試驗(yàn)，采用YeastOne真菌藥物敏感性試驗(yàn)試劑盒（美國賽默飛世爾公司）進(jìn)行檢測，72 h后使用SensititreVizion全自動(dòng)藥物敏感性試驗(yàn)判讀系統(tǒng)判讀結(jié)果。同時(shí)，進(jìn)行近平滑念珠菌（ATCC 22019）和克柔念珠菌（ATCC 6258）藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)量控制，24 h質(zhì)量控制檢測結(jié)果均在控。參考隱球菌屬微量肉湯稀釋法常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)ECV值[5]（表1），≤ECV值判讀為野生型，>ECV值判讀為非野生型。對該菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判讀：氟康唑4 μg/mL（野生型）、伊曲康唑0.03 μg/mL（野生型）、泊沙康唑0.03 μg/mL（野生型）、兩性霉素B 0.5 μg/mL（野生型）、5-氟胞嘧啶1 μg/mL（野生型）、伏立康唑0.015 μg/mL（野生型），米卡芬凈8 μg/mL（天然耐藥）、阿尼芬凈8 μg/mL（天然耐藥）和卡泊芬凈8 μg/mL（天然耐藥）。

3 討論

隱球菌廣泛分布于土壤、鴿糞等自然環(huán)境中，是常見的條件致病性真菌。通過呼吸系統(tǒng)進(jìn)入人體發(fā)生定植和感染，可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚、骨骼系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等，對腦和腦膜有特殊的親和力。隱球菌性腦膜腦炎是由隱球菌侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的一種深部侵襲性真菌病，多見于免疫功能受抑制和免疫功能低下的患者，免疫功能正常者罕見發(fā)病[6-9]。

隱球菌性腦膜腦炎的臨床表現(xiàn)多無特異性，影像學(xué)診斷也缺乏特異性。常表現(xiàn)為進(jìn)行性頭痛加劇，病程遷延，常伴有惡心、嘔吐及視力障礙。肺部感染常見多發(fā)性結(jié)節(jié)，隱球菌莢膜抗原快速檢測可以早期快速篩查隱球菌肺部感染。目前，腦脊液真菌培養(yǎng)鑒定仍是鑒定隱球菌性腦膜腦炎的唯一“金標(biāo)準(zhǔn)”[10-11]。隱球菌性腦膜腦炎的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查與結(jié)核性腦膜炎極為相似，臨床容易誤診[8，12]。本例患者系平時(shí)體健中年男性，無基礎(chǔ)疾病，急性起病，持續(xù)頭痛伴發(fā)熱，癥狀逐漸加重，病情進(jìn)展快，符合隱球菌性腦膜腦炎的表現(xiàn)，臨床上比較罕見。

有學(xué)者對1 049例艾滋病患者的血液和腦脊液樣本進(jìn)行檢測方法學(xué)比較后發(fā)現(xiàn)，血清隱球菌抗原檢測是診斷隱球菌感染的理想方法[11]。對誤診隱球菌性腦膜腦炎的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，4例患者均以頭痛起病，病程中均出現(xiàn)發(fā)熱，被誤診為病毒性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎及上呼吸道感染各1例。最終通過腦脊液墨汁染色檢出新生隱球菌，確診為新生隱球菌性腦膜腦炎[12]。近年來，隱球菌性腦膜腦炎和隱球菌性肺炎的發(fā)病率有不斷升高的趨勢，臨床應(yīng)提高與病毒性腦膜炎或肺炎等疾病相鑒別的能力，選擇合適的檢測項(xiàng)目，早期快速確診。對疑似隱球菌感染的患者，血清隱球菌莢膜抗原檢測和腦脊液墨汁染色可提高診斷的及時(shí)性和準(zhǔn)確性。通過真菌培養(yǎng)，對腦脊液和血液標(biāo)本進(jìn)行隱球菌分離培養(yǎng)，進(jìn)行規(guī)范的真菌藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)合現(xiàn)有的隱球菌ECV出具藥物敏感性報(bào)告，可以早期診斷并實(shí)施精準(zhǔn)治療。

目前，臨床治療隱球菌病的藥物僅限于兩性霉素B、唑類和5-氟胞嘧啶，長期使用抗真菌藥物可引起隱球菌耐藥，從而導(dǎo)致臨床治療失敗。隱球菌感染治療費(fèi)用昂貴，治療周期漫長[13]，因此迫切需要對其耐藥性進(jìn)行監(jiān)測，對其耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究，對臨床探索有效治療方案具有重要意義[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌對伏立康唑和兩性霉素B的耐藥率為1.32%，對5-氟胞嘧啶的耐藥率為0.33%[15]。在長期的抗真菌治療過程中，隱球菌對抗真菌藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥，從而導(dǎo)致治療失敗。因此，臨床治療需要實(shí)驗(yàn)室的體外藥物敏感性試驗(yàn)報(bào)告作為合理用藥的依據(jù)[16]。

本研究通過對該患者進(jìn)行血清、腦脊液的隱球菌莢膜抗原檢測，快速確診為隱球菌感染，結(jié)合血培養(yǎng)和腦脊液培養(yǎng)分離出致病真菌，為臨床確診提供了重要證據(jù)。對于肺部影像學(xué)檢查有結(jié)節(jié)，并且具有肺部或者腦部癥狀的患者，早期篩查隱球菌莢膜抗原具有重要意義。對分離的隱球菌進(jìn)行質(zhì)譜快速鑒定，可以準(zhǔn)確鑒定到種。采用商品化真菌藥敏試劑盒進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)合隱球菌ECV發(fā)布藥物敏感性報(bào)告，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐R床溝通和結(jié)果解釋，有助于推動(dòng)臨床合理使用抗真菌藥物，提高隱球菌感染的臨床治愈率。