張?jiān)汽悾?王 鑫， 邵 玲， 曲 波， 趙鴻梅

（遼寧省人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110016）

2020年2月11日，國際病毒分類委員會(huì)將新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的致病原命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）[1]。我國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[2]中規(guī)定實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測SARS-CoV-2陽性為COVID-19的確診指標(biāo)之一。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[3]，在COVID-19早期診斷及阻斷疾病傳播中起關(guān)鍵作用，為SARS-CoV-2感染的防控提供了強(qiáng)有力的保障[4]。

目前，SARS-CoV-2核酸檢測普遍在各醫(yī)療機(jī)構(gòu)的二級及以上生物安全實(shí)驗(yàn)室開展。大部分實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測時(shí)都會(huì)按照試劑說明書要求使用配套核酸提取或純化試劑（磁珠吸附法），將采集的鼻/咽拭子置于病毒保存液中，56 ℃滅活30 min后使用自動(dòng)化設(shè)備提取核酸。樣本釋放劑法是將采集的拭子樣本放入含有樣本核酸釋放劑的保存液中，使樣本中的RNA釋放，依據(jù)液可直接作為聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）模板進(jìn)行擴(kuò)增，無需加熱滅活或其他核酸提取操作。該法操作更為簡便，耗時(shí)更短。本研究參照CNAS-CL02-A009《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[5]、CNAS-GL039《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》[6]文件對這2種不同的核酸提取方法所使用的3種試劑進(jìn)行符合率、重復(fù)性、檢出限比較，評估樣本釋放劑是否可替代磁珠吸附法應(yīng)用于臨床，為實(shí)驗(yàn)室人員合理選擇SARSCov-2 核酸提取方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

陽性樣本為SARS-CoV-2 RNA液體性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品（廣州邦德盛公司）。濃度為2.0×106拷貝/mL及2.0×105拷貝/mL的SARS-CoV-2 RNA假病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品編號分別為GBW（E）091133及GBW（E）091132。陰性樣本為健康體檢者的咽拭子樣本。

1.2 試劑和儀器

樣本釋放劑A購自廣東國盛醫(yī)學(xué)科技有限公司。樣本釋放劑B、磁珠吸附法核酸提取試劑和DA3200核酸提取儀、SARS-CoV-2核酸檢測試劑均購自廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。Cobas z480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自瑞士羅氏公司。XK80-A型快速混勻器購自深圳市瑞鑫達(dá)科教儀器貿(mào)易部。

1.3 檢測方法

1.3.1 核酸提取 按照樣本釋放劑法核酸提取試劑的說明書，采集樣本后將采樣管滅活、震蕩、離心，吸取上清液作為PCR模板，加入到PCR體系中進(jìn)行擴(kuò)增。按照磁珠吸附法核酸提取試劑的說明書，使用核酸提取儀自動(dòng)提取SARSCoV-2 RNA，樣本用量為200 μL，核酸洗脫液體積為100 μL。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 采用SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒對不同核酸提取方法制備的SARS-CoV-2 核酸進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR條件：50 ℃ 15 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。FAM通道結(jié)果代表SARS-CoV-2 N基因，VIC通道結(jié)果代表SARSCoV-2 ORF1ab基因，Cy5通道結(jié)果代表內(nèi)標(biāo)基因。陽性標(biāo)準(zhǔn)為FAM和VIC通道有明顯擴(kuò)增曲線，且循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）≤40；陰性標(biāo)準(zhǔn)為FAM和VIC通道無擴(kuò)增曲線或Ct值>40，且Cy5通道有擴(kuò)增曲線；如僅在FAM或VIC單一通道Ct≤40，另一條通道無擴(kuò)增曲線，結(jié)果需復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果一致可判為陽性，復(fù)檢均為陰性則為陰性。

1.4 方法比較

1.4.1 符合率 選取陰性樣本10例、陽性標(biāo)準(zhǔn)品10例。分別采用樣本釋放劑法和磁珠吸附法提取SARS-CoV-2 核酸后進(jìn)行檢測并以Ct值評價(jià)結(jié)果的陰、陽性。以磁珠吸附法為參比方法，樣本釋放劑法為待評價(jià)方法，根據(jù)2種方法的檢測結(jié)果計(jì)算不同方法間的總符合率、陰性符合率及陽性符合率。

1.4.2 重復(fù)性 10份2水平（低值、中值）陽性質(zhì)控品分別使用不同核酸提取方法進(jìn)行核酸提取及擴(kuò)增。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的Ct值變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）比較不種方法的重復(fù)性。

1.4.3 檢出率和檢出限 將含有2.0×104拷貝/mL SARS-CoV-2 核酸的定值標(biāo)準(zhǔn)品用去RNA酶水進(jìn)行20～28倍梯度稀釋，稀釋后的樣本使用不同核酸提取試劑進(jìn)行檢測，每水平重復(fù)5次，根據(jù)Ct＜40陽性結(jié)果的檢出率評價(jià)各方法的檢出率及檢出限。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2013軟件、GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 符合率

陽性標(biāo)準(zhǔn)品使用3種試劑提取核酸后檢出結(jié)果均為陽性（N基因、ORF1ab基因及內(nèi)標(biāo)基因Ct值均＜40）。經(jīng)過嚴(yán)格臨床培訓(xùn)的采樣人員使用3種不同試劑采集的10例正常人咽拭子樣本，結(jié)果均為陰性（N基因及ORF1ab基因未檢出，內(nèi)標(biāo)基因Ct值＜40）。3種核酸提取試劑的總符合率、陽性符合率及陰性符合率均為100%。見圖1。

圖1 3種不同核酸提取試劑陰陽性樣本的符合率結(jié)果

2.2 重復(fù)性

使用3種核酸提取試劑對低值質(zhì)控品及中值質(zhì)控品進(jìn)行核酸提取及擴(kuò)增。低值質(zhì)控品均值為1.61×103拷貝/mL，濃度范圍為5.04×102～5.17×103拷貝/mL；中值質(zhì)控品均值為1.45×104拷貝/mL，濃度范圍為4.60×103～4.55×104拷貝/mL）。磁珠吸附法試劑提取核酸的CV（CV為0.89%～1.58%）低于樣本釋放劑B（CV為0.83%～2.73%）和樣本釋放劑A（CV為1.62%～4.90%）。見表1。

表1 3種核酸提取試劑對低值和中值質(zhì)控品進(jìn)行核酸提取及擴(kuò)增的重復(fù)性

2.3 檢出率和檢出限

磁珠吸附法提取核酸后N基因的檢出率為100%，ORF1ab基因的檢出率為97.8%，2個(gè)基因同時(shí)檢出的檢出率為97.8%。樣本釋放劑A提取核酸后N基因的檢出率為84.4%，ORF1ab基因的檢出率為75.6%，2個(gè)基因同時(shí)檢出的檢出率為75.6%。樣本釋放劑B提取核酸后N基因的檢出率為100%，ORF1ab基因的檢出率為93.3%，2個(gè)基因同時(shí)檢出的檢出率為93.3%。使用磁珠吸附法試劑進(jìn)行核酸提取的檢出限為156.3拷貝/mL，樣本釋放劑A的檢出限為625.0拷貝/mL，樣本釋放劑B的檢出限為156.3拷貝/mL。見圖2。

圖2 3種不同核酸提取試劑梯度稀釋（20～28倍）樣本檢測結(jié)果

3 討論

COVID-19疫情作為突發(fā)公共衛(wèi)生事件，傳播迅速、廣泛，給全世界人民的生命健康帶來巨大威脅[7]。敏感性及特異性較高的核酸檢測方法為病毒的早期診斷、疫情監(jiān)測提供了可行的解決方案[8]。目前，SARS-CoV-2核酸檢測一般使用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR。在檢測過程中，病毒核酸的提取是關(guān)鍵步驟之一，提取的效率和質(zhì)量可直接影響最終檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。不同的核酸提取方法因其提取產(chǎn)物濃度、純度的差別及對核酸的保護(hù)程度不同，一定程度上影響病毒核酸尤其是臨界陽性標(biāo)本的核酸檢出[9]。因此，選擇一種高效的核酸提取方法，對保證核酸檢測結(jié)果的快速與準(zhǔn)確是至關(guān)重要的。

理論上，病毒載量越高，提取的病毒核酸越多，可以反映在所對應(yīng)檢測結(jié)果的Ct值上[10]。張運(yùn)洪等[11]的研究結(jié)果顯示，使用核酸裂解液進(jìn)行SARS-CoV-2核酸提取檢出率低，效果不如磁珠吸附法好。本研究從符合率、重復(fù)性及檢出率綜合比較樣本釋放劑法與磁珠吸附法的性能，分析其優(yōu)缺點(diǎn)，以期找到更適用于臨床的核酸提取方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，在符合率方面，3種核酸提取試劑的陰、陽性樣本結(jié)果符合率均為100%。在重復(fù)性方面，磁珠吸附法試劑提取核酸的CV最低，重復(fù)性最佳，樣本釋放劑B次之，樣本釋放劑A的 CV最大。檢測不同濃度水平的樣本，磁珠吸附法試劑提取核酸后N基因和ORF1ab基因同時(shí)檢出的檢出率為97.8%，樣本釋放劑A為75.6%，樣本釋放劑B為93.3%。磁珠吸附法及樣本釋放劑B的檢出限均為156.3 拷貝/mL，樣本釋放劑A的檢出限為625.0 拷貝/mL。3種試劑說明書聲明的檢出限均為500 拷貝/mL。磁珠吸附法試劑及樣本釋放劑B的檢出限符合要求，而樣本釋放劑A的檢出限不符合要求。在提取操作時(shí)間上，磁珠吸附法通過儀器自動(dòng)化或半自動(dòng)化分批進(jìn)行核酸提取，提取前后都需要手工加樣。使用樣本釋放劑無需設(shè)備，只需震蕩、靜置、離心后加樣1次即可完成，操作更為簡便。因此，磁珠吸附法適合大批量樣本，樣本釋放劑法適合少量樣本。磁珠吸附法的試劑成本高于樣本釋放劑法。

磁珠吸附法的原理是通過含強(qiáng)力蛋白變性劑的磁珠結(jié)合液將樣本中的蛋白質(zhì)迅速溶解，使核酸解離出來結(jié)合在磁珠上，隨后通過磁場的作用和磁珠洗滌液的作用將雜質(zhì)去除，最后將純凈的核酸洗脫下來。樣本釋放劑主要成分包括核酸釋放液和保存液，可使細(xì)胞或病毒的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性，滅活病毒，通過震蕩和浸泡使核酸被快速釋放，對核酸具有一定的保護(hù)作用。采樣后按說明書要求震蕩、靜置、離心，即可吸取上清液作為模板，加入PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。磁珠吸附法是目前較常用的核酸提取方法，具有簡便、高效、提取濃度及純度較高等優(yōu)勢[12-13]，且可通過儀器自動(dòng)化批量提取，操作簡單。磁珠吸附法與樣本釋放劑法相比，經(jīng)過了去除雜質(zhì)的核酸提純過程，且每份樣本加樣量相對均一，結(jié)果重復(fù)性好。樣本釋放劑法不經(jīng)提純，得到的核酸量與采樣人員的采樣操作密切相關(guān)，雖然操作快速、簡便，但結(jié)果重復(fù)性不如磁珠吸附法好。另外，由于試劑組分不同，不同樣本釋放劑的核酸提取性能也有一定的差異。

綜上所述，相對于樣本釋放劑法，磁珠吸附法提取效率更高、結(jié)果重復(fù)性更好，適合大批量樣本的操作。