葉松道， 陳允國， 葉宣梅

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325027）

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起的以肝臟疾病和肝外疾病為特征的進(jìn)展性疾病，全球范圍內(nèi)HCV感染者超過1.85億[1]。HCV感染后如不能及時(shí)清除病毒，易發(fā)展為慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC），而CHC是肝硬化、肝細(xì)胞癌的主要病因之一，因此對丙型肝炎慢性化機(jī)制的研究以及如何提高治療應(yīng)答率是目前臨床關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）是一類能對干擾素的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，與病原體的免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞的增殖調(diào)控等關(guān)系密切。IRF-3作為IRF家族中的重要成員，在抗病毒反應(yīng)過程中起非常重要的作用[3]。本研究擬探討CHC患者血漿IRF-3水平在CHC診斷、治療及發(fā)病機(jī)制中的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 CHC組 選取2017年9月—2018年8月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染內(nèi)科就診的CHC患者57例，其中男32例、女25例，年齡10～76歲，均符合《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[4]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。入選標(biāo)準(zhǔn)：HCV感染超過6個(gè)月，或有6個(gè)月前的流行病學(xué)史，抗HCV抗體及HCV RNA陽性，肝臟組織病理學(xué)檢查符合慢性肝炎的特征，3個(gè)月內(nèi)未接受抗病毒治療、未使用免疫調(diào)節(jié)劑，能接受PR方案[聚乙二醇干擾素α（每次180 μg，每周1次，皮下注射）+利巴韋林（800～1 000 mg/d）]治療并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并慢性乙型肝炎等其他病毒性肝炎者，合并酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝炎等其他肝病以及人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染、惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、甲狀腺疾病、糖尿病者，病歷資料不全導(dǎo)致影響療效和安全性判斷者。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對象均為浙江地區(qū)非血緣漢族個(gè)體。

1.1.2 正常對照組 選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心健康體檢者26名，其中男15名、女11名，年齡13～74歲，肝功能正常，無肝病、腎病、血液病、自身免疫性疾病和心腦血管疾病的病史，排除甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒和巨細(xì)胞病毒等感染。

1.1.3 療效判斷 所有CHC患者均采用PR方案治療，基本療程為48周。治療前及治療第4、12、24、48周檢測其HCV RNA載量，評估病毒應(yīng)答情況，并據(jù)此調(diào)整藥物劑量。療效判斷[4]：（1）快速病毒學(xué)應(yīng)答，治療第4周HCV RNA載量＜5.0×102拷貝/mL；（2）早期病毒學(xué)應(yīng)答，治療第12周HCV RNA載量較治療前下降>2log；（3）無應(yīng)答：治療第12周 HCV RNA載量較治療前下降＜2log；（4）持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答，治療結(jié)束后第12周和第24周HCV RNA＜5.0×102拷貝/mL。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集所有對象空腹靜脈血3～4 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，立刻上下顛倒混勻10次，1 500×g離心5 min，分離血漿，置于-40 ℃保存，用于檢測IRF-3、β-干擾素（beta-interferon，IFN-β）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、Ⅳ型膠原（type Ⅳ collagen，CⅣ）水平及HCV RNA載量。

1.2.2 血漿IRF-3、IFN-β水平測定 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血漿IRF-3、IFN-β水平，試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司，檢測儀器為Anthos 2010型酶標(biāo)儀（上海博賽思科技有限公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 HCV RNA定量分析 采用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測HCV RNA載量，試劑盒購自深圳匹基生物工程公司，檢測儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行操作。以HCV RNA≥5×102拷貝/mL為異常。參考《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[4]，根據(jù)血漿HCV RNA載量將CHC患者分為HCV RNA高載量組（HCV RNA≥4×105拷貝/mL）和HCV RNA低載量組（HCV RNA＜4×105拷貝/mL）。

1.2.4 血漿CⅣ水平測定 采用MAGLUMI 2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（深圳新產(chǎn)業(yè)生物有限公司）及配套試劑（化學(xué)發(fā)光法）檢測血漿CⅣ水平，參考區(qū)間為0～30 ng/mL。根據(jù)血漿CⅣ檢測結(jié)果，將CHC患者分為CⅣ升高組（CⅣ>30 ng/mL）和CⅣ正常組（CⅣ≤30 ng/mL）。

1.2.5 血漿ALT水平測定 采用ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀（德國西門子公司）及配套試劑（速率法）、校準(zhǔn)品檢測血漿ALT水平，參考區(qū)間為10～49 U/L。根據(jù)血漿ALT檢測結(jié)果，將CHC患者分為ALT升高組（ALT>49 U/L）和ALT正常組（ALT≤49 U/L）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)分析評估各項(xiàng)目之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHC組與正常對照組血漿IRF-3、IFN-β水平的比較

CHC組血漿IRF-3 、IFN-β水平明顯低于正常對照組（P＜0.01）。見表1。

表1 CHC組與正常對照組血漿IRF-3、IFN-β水平的比較 M（P25～P75），pg/mL

2.2 CHC患者血漿IRF-3水平與血漿ALT、CⅣ水平及HCV RNA載量的關(guān)系

ALT升高組與ALT正常組之間、CⅣ升高組與CⅣ正常組之間、HCV RNA高載量組與HCV RNA低載量組之間血漿IRF-3水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2～表4。

表2 ALT升高組與ALT正常組血漿IRF-3水平的比較 M（P25～P75），pg/mL

表3 CⅣ升高組與CⅣ正常組血漿IRF-3水平的比較 M（P25～P75），pg/mL

表4 HCV RNA高載量組與低載量組血漿IRF-3水平的比較 M（P25～P75），pg/mL

Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，CHC患者IRF-3與IFN-β呈正相關(guān)（r=0.930，P＜0.01），與HCV RNA、ALT、CⅣ均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.321、-0.290、-0.345，P＜0.05）。IFN-β與HCV RNA、ALT、CⅣ均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.297、-0.294、-0.302，P＜0.05）。

2.3 CHC患者血漿IRF-3、IFN-β水平與干擾素療效的關(guān)系

57例CHC患者中失訪7例。根據(jù)療效將完成隨訪的50例患者分為應(yīng)答組（27例，包括早期應(yīng)答、延遲應(yīng)答、部分應(yīng)答）、無應(yīng)答組（23例）。應(yīng)答組血漿IRF-3水平低于無應(yīng)答組（P＜0.05），血漿IFN-β水平2個(gè)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表5。

表5 無應(yīng)答組與應(yīng)答組IRF-3、IFN-β水平的比較 M（P25～P75），pg/mL

3 討論

HCV是引發(fā)慢性肝炎的主要病原體之一，由于HCV感染分布廣、慢性率高，且缺乏有效的HCV疫苗，因此已成為威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅有20%～30%的HCV感染者可自發(fā)清除病毒，而70%～80%的感染者會(huì)持續(xù)感染，約有30%的CHC最終發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞肝癌[1]。丙型肝炎患者肝臟損傷的主要原因是HCV感染后引起的免疫學(xué)應(yīng)答，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）起重要作用[5]。丙型肝炎慢性化的機(jī)制尚未被闡明，一般認(rèn)為是宿主免疫、遺傳易感性和HCV共同作用的結(jié)果。

IRF在病原體的免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的增殖調(diào)控、造血干細(xì)胞的發(fā)育分化和腫瘤的免疫應(yīng)答等方面起重要作用。IRF-3作為IRF家族中的重要成員，在病毒感染早期與IFN基因表達(dá)的高低有關(guān)[6]。IRF-3主要的功能是誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素、干擾素刺激基因（interferonstimulated gene，ISG）和促炎細(xì)胞因子的生成。有研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒、HCV、HIV等多種病毒能與細(xì)胞表面受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的IRF-3迅速活化，啟動(dòng)ISG轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞因子生成，阻止病毒的復(fù)制和擴(kuò)散[7]。當(dāng)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞開始復(fù)制后，病毒成分能夠通過多種途徑抑制IRF-3的表達(dá)、磷酸化和核轉(zhuǎn)移，這是病毒逃避固有免疫應(yīng)答的方式之一[8]。

本研究結(jié)果顯示，CHC患者血漿IRF-3、IFN-β水平明顯低于正常對照者，且IRF-3與IFN-β呈正相關(guān)（r=0.930，P＜0.01），與HCV RNA、ALT及CⅣ均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.321、-0.290、-0.345，P＜0.05）。血漿ALT水平的高低與患者肝細(xì)胞的損傷程度有關(guān)，在一定程度上可以反映病情的嚴(yán)重程度。CⅣ是基底膜的主要成分，是反映肝纖維化進(jìn)程的良好指標(biāo)，對肝硬化的診斷有重要的臨床價(jià)值[9]。HCV RNA載量不僅是判斷HCV感染的主要依據(jù)，也是CHC患者干擾素療效判斷的重要參數(shù)[10]。IRF-3可能通過調(diào)控Ⅰ型干擾素（α-干擾素和IFN-β）的表達(dá)參與HCV復(fù)制、肝細(xì)胞損傷及肝纖維化過程。因此，血漿IRF-3水平或可作為HCV感染潛在的診斷標(biāo)志物。丙型肝炎直接抗病毒（direct-acting antiviral agent，DAA）藥物具有很多優(yōu)勢，有部分藥物已在我國上市，但其使用尚處于臨床初始階段，針對不同人群的用藥經(jīng)驗(yàn)相對不足，而且DAA藥物的費(fèi)用較高，因此PR方案仍是我國現(xiàn)階段治療丙型肝炎的主要方法[11]。然而，CHC患者對PR方案標(biāo)準(zhǔn)療程的持續(xù)應(yīng)答率僅為50%～60%[12]，原因除與HCV的數(shù)量、毒力及基因結(jié)構(gòu)等有關(guān)[13-14]外，還與患者的性別、年齡及機(jī)體免疫狀態(tài)密切相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)答組基線IRF-3水平明顯低于無應(yīng)答組（P＜0.05），表明血漿IRF-3水平可能有助于干擾素療效的判斷。

總之，血漿IRF-3水平和CHC患者的HCV RNA載量、病情及干擾素療效均有較密切的關(guān)系，或可作為炎癥活動(dòng)性和肝臟損傷程度的評價(jià)指標(biāo)，對干擾素療效的判定也有一定的價(jià)值。