馮世鑫 蔣妮 陳乾平 蔣水元 唐輝

(1廣西壯族自治區(qū)藥用植物園廣西南寧530023;2廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所廣西桂林541006)

羅漢果［Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey］為葫蘆科羅漢果屬植物，也是藥食兩用甜味植物，其果實(shí)為常用大宗藥材。主產(chǎn)于中國廣西，廣東、福建有引種。羅漢果含羅漢果甜苷、黃酮、維生素等活性成分，具有清熱潤肺、利咽開音、潤腸通便等作用［1］。羅漢果甜苷是一種低熱量高甜度天然甜味劑，其甜度堪稱世界之最［2］；除作中藥制劑以外，還可將其提取加工成為一種新型甜味劑，廣泛應(yīng)用于保健品、飲料之中。羅漢果產(chǎn)品暢銷全國和歐美國家，成為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)收入主要來源。

羅漢果的生產(chǎn)過程受根結(jié)線蟲病的嚴(yán)重影響，常造成生長不良、萎蔫、甚至死亡。有研究報(bào)道，在不使用殺線農(nóng)藥的情況下，根結(jié)線蟲發(fā)病率高達(dá)86.67%，其病情指數(shù)達(dá)61.78%［3］，植株受為害后，枯萎病、根腐病等土傳性病害發(fā)生嚴(yán)重，造成復(fù)合侵染［4］。根結(jié)線蟲病感染所造成的減產(chǎn)輕者為15%～30%，重者達(dá)60%～70%［5］，嚴(yán)重制約著羅漢果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。羅漢果根結(jié)線蟲病病原主要為南方根結(jié)線蟲（MeloidogyneincognitaChitwood）［6］，是一種定居型內(nèi)寄生線蟲，分布于10～30 cm土層，一年發(fā)生4～6代，世代重疊，常以卵和2齡前幼蟲隨病株殘?bào)w遺留在土壤中越冬，以2齡幼蟲侵入根內(nèi)；以病土、灌溉水、病苗、農(nóng)具，以及施用未腐熟農(nóng)家肥方式傳播。生產(chǎn)上，常使用滅線磷（ethoprophos）、米樂爾（isazofos）、克線磷（nemacur）、氯化苦等高毒、高殘留農(nóng)藥來防治，且藥劑用量逐年加大，造成產(chǎn)品農(nóng)殘超標(biāo)和環(huán)境污染，已威脅到人類身體健康。許多相關(guān)學(xué)者致力于動(dòng)植物和微生物及其代謝物的殺線劑研發(fā)。微生物菌肥主要是通過微生物的生命活動(dòng)使作物獲得特定的肥料效應(yīng)或生防效應(yīng)［7］。目前以擬淡紫青霉、哈茨木霉菌劑對(duì)根結(jié)線蟲病防治效果較好，但應(yīng)用于大田時(shí)則防效較低［8-9］。改良型微生物菌肥是本研究組自主研制的產(chǎn)品，是以桐麩、油茶麩和蓖麻籽為主體，殖入長柄平菇菌、枯草芽孢桿菌，并增加低聚殼聚糖、有機(jī)硒等發(fā)酵精制而成，為植物源與微生物源相結(jié)合的功能性微生物菌肥，初步發(fā)現(xiàn)該菌肥具有促進(jìn)植物生長和抑制線蟲活性的作用。為更好地開發(fā)和利用這一微生物菌肥，在室內(nèi)毒力試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探討其在大田中對(duì)羅漢果根結(jié)線蟲病的防治效果及對(duì)土壤酶活性的影響，為促進(jìn)羅漢果產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2019年4月在廣西壯族自治區(qū)桂林市永?？h永福鎮(zhèn)漁洞村進(jìn)行。試驗(yàn)地為連作3年種植羅漢果的地塊，該地塊為丘陵地，沙質(zhì)壤土，含有機(jī)質(zhì)11.67 g/kg，全氮0.29 g/kg，堿解氮87.65 mg/kg，速效磷39.47 mg/kg，速效鉀104.26 mg/kg，pH 6.3。

1.1.2 材料

試驗(yàn)所用的改良型微生物菌肥（以下簡(jiǎn)稱為微生物菌肥）由廣西藥用植物園自主研制；淡紫擬青霉顆粒劑由北京德瑞?？萍奸_發(fā)有限公司生產(chǎn)，有效菌數(shù)為0.2×108cfu/g；復(fù)合肥由歐洲化學(xué)安特衛(wèi)普公司生產(chǎn)，中國中化集團(tuán)有限公司提供的獅馬牌復(fù)合肥，含氮15%、磷15%、鉀15%。種苗為廣西藥用植物園培育的普豐青皮羅漢果扦插苗。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置微生物菌肥施肥水平如下：T1，1 kg/株；T2，2 kg/株；T3，3 kg/株；T4，4 kg/株。以淡紫擬青霉顆粒劑47 g/株＋復(fù)合肥0.5 kg/株的處理作為對(duì)照（為體現(xiàn)“改良的微生物肥”是在現(xiàn)階段水平下的創(chuàng)新，選用淡紫擬青霉顆粒劑作對(duì)照）。羅漢果種植的株行距為2.0 m×2.5 m，以土堆的形式種植。將各處理的肥料總量一次性施入，與土堆中的土拌勻后，用黑色地膜覆蓋，四周壓緊。種植時(shí)，在土堆的頂部將地膜開口，開淺坑，將袋裝種苗去除營養(yǎng)袋后植入，輕壓，淋水。小區(qū)面積為45 m2，3次重復(fù)。

1.2.2 性狀測(cè)定

1.2.2.1 土壤蟲口減退率

在處理前和處理后的40、80、120 d分別取根際土壤100 mL，用改良貝爾曼漏斗法分離線蟲；在解剖鏡下，調(diào)查根結(jié)線蟲2齡幼蟲的數(shù)量，計(jì)算各生長時(shí)期2齡幼蟲蟲口退減率（簡(jiǎn)稱蟲口減退率，下同）。計(jì)算公式如下：

蟲口退減率＝（處理前2齡幼蟲數(shù)－處理后2齡幼蟲數(shù)）/處理前線蟲數(shù)量×100%

1.2.2.2 土壤酶活性測(cè)定

在處理后的40、80、120 d分別取根際土壤，測(cè)定脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶的活性。參照朱新玉等方法［10］，采用靛酚比色法測(cè)定脲酶活性；用磷酸苯二鈉法測(cè)定磷酸酶的活性；用高錳酸鉀滴定法測(cè)定過氧化氫酶活性。

1.2.2.3 防效調(diào)查

在11月果實(shí)采收后，將根部挖出，用清水洗凈，查看根部出現(xiàn)根結(jié)的數(shù)量，計(jì)算根結(jié)發(fā)病株率、病情指數(shù)和相對(duì)防效。根結(jié)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［11］分為0～6級(jí)，具體如下：

0級(jí)，無根結(jié)；

1級(jí)，10%以下的根出現(xiàn)根結(jié)；

2級(jí)，10%～20%的根出現(xiàn)根結(jié)；

3級(jí)，21%～40%的根出現(xiàn)根結(jié)；

4級(jí)，4l%～60%的根出現(xiàn)根結(jié)；

5級(jí)，61%～80%的根出現(xiàn)根結(jié)；

6級(jí)，8l%～100%的根出現(xiàn)根結(jié)。

計(jì)算公式為：

根結(jié)發(fā)病株率＝根結(jié)發(fā)病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%

病情指數(shù)＝Σ（病級(jí)數(shù)×該級(jí)發(fā)病株數(shù)）/（調(diào)查總株×最高級(jí)數(shù)）×100

相對(duì)防效＝（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.2.2.4 果實(shí)產(chǎn)量和有機(jī)硒含量的測(cè)定

在果柄變黃時(shí)，分批采收，統(tǒng)計(jì)結(jié)果數(shù)量，參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)羅漢果（NY/T694）方法分級(jí)，計(jì)算中大果比率。后熟7 d后，烘烤至干；隨機(jī)選取30個(gè)中果，測(cè)定單果重和硒含量，硒含量參照GB 5009.93—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》中的氫化物原子熒光光譜法測(cè)定。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Duncan’s法分析檢驗(yàn)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌肥對(duì)羅漢果根結(jié)線蟲病的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，施用微生物菌肥可顯著降低土壤中根結(jié)線蟲2齡幼蟲的數(shù)量，蟲口減退率有隨著施肥水平的增加而增大的趨勢(shì)，其中T4處理在施用80 d時(shí)蟲口減退率最高（表1），達(dá)到67.8%，顯著高于對(duì)照；其次為T3，在施用40和80 d時(shí)，T3與T4的蟲口減退率差異不顯著；到了120 d時(shí)，T3處理的蟲口減退率則顯著低于T4的，說明微生物菌肥對(duì)土壤線蟲的抑制持久性與施用水平呈正相關(guān)性。在同一處理中，隨著施肥后時(shí)間的延長，4個(gè)處理的蟲口減退率均表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)，均在施肥后80 d達(dá)到頂峰，之后皆有所下降；施用120 d時(shí)，與80 d相比，T4蟲口減退率下降2.1%，T3下降3.2%，T1下降幅度最大，達(dá)到8.7%。說明微生物菌肥要發(fā)揮最大的作用需要一定的時(shí)間，但超過一定的時(shí)限后對(duì)羅漢果根結(jié)線蟲抑制作用出現(xiàn)衰減，施肥量較大的處理比施肥量小的衰減幅度小。在采收后，對(duì)植株根部受害情況的調(diào)查結(jié)果顯示，根結(jié)發(fā)病株率、病情指數(shù)均有隨著施肥水平的提高而降低，各處理間的差異達(dá)到顯著水平。以T4處理的相對(duì)防效最高，達(dá)到77.14%。

2.2 微生物菌肥對(duì)土壤酶活性的影響

脲酶廣泛存活于土壤中，參與有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化，其活性增強(qiáng)促進(jìn)有機(jī)氮的水解和吸收。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施用微生物菌肥后，根圍土壤的脲酶活性在一定程度上得到增強(qiáng)，在不同時(shí)期所表現(xiàn)的活性不盡相同。在施用后40和80 d時(shí)，各處理的脲酶活性均顯著高于對(duì)照，并隨著施用量的增加呈先增后降的趨勢(shì)，其中以T3處理的活性最高。隨著時(shí)間的推移，在施肥后120 d時(shí)，T4土壤脲酶活性反高于T3處理的，表現(xiàn)為隨著施肥水平的增加而升高，兩者差異不顯著，但此時(shí)T1處理的脲酶活性已與CK基本持平（表2）。反映出在一定時(shí)間內(nèi)，適量的菌肥有利于持續(xù)提高根際土壤的脲酶活性。

表1 微生物菌肥對(duì)羅漢果根結(jié)線蟲的發(fā)生調(diào)查表

磷酸酶為土壤中重要的作用酶之一，能促進(jìn)有機(jī)磷化合物或無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化，有利于植物對(duì)磷的吸收、利用。結(jié)果表明（表2），微生物菌肥能促進(jìn)根際土壤磷酸酶活性的提高，磷酸酶活性隨著菌肥施用量的增加呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，其中以T3處理較好，表現(xiàn)為在施用后80和120 d土壤磷酸酶活性均最高，其中在120 d時(shí)顯著高于對(duì)照和其他處理；其次為T2，T2表現(xiàn)為速效、早退，在施用后的40 d土壤磷酸酶活性較高，至80 d時(shí)磷酸酶活性也顯著高于CK、T1和T4處理，但與T3處理的差異未達(dá)到顯著水平；至120 d時(shí)T2酶活性顯著低于T3。T4處理表現(xiàn)為遲效，在施用后120 d磷酸酶活性呈現(xiàn)提升的態(tài)勢(shì)，與T2處理基本持平。說明中等量的微生物肥更有利于磷酸酶活性的提高。

表2 施用微生物菌肥對(duì)羅漢果土壤酶活性的影響

過氧化氫酶是土壤中的氧化還原酶之一，有助于過氧化氫的分解，降低土壤有害物質(zhì)對(duì)生物體的毒害作用，其活性可反映出土壤腐殖質(zhì)化程度和有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化速率。從試驗(yàn)結(jié)果（表2）可看出，在施用菌肥后的40、80、120 d，各處理的根際土壤過氧化氫酶活性均顯著高于對(duì)照，且均隨著微生物菌肥施用量的增加而升高，但不同時(shí)期各施肥處理的差異性不同。在施后40 d時(shí)，各處理之間差異不顯著；在施用后80 d時(shí)，以T4處理的過氧化氫酶活性最高，其次為T3處理的，二者之間差異不顯著，但顯著高于T1、T2；至120 d時(shí)，仍以T4處理最高，顯著高于其他處理。說明微生物菌肥可提高過氧化氫酶活性，隨著處理時(shí)間的延長，不同施肥水平下過氧化氫酶活性不同，水平越高酶活性越高。

2.3 微生物菌肥對(duì)羅漢果產(chǎn)量和硒富集的影響

市場(chǎng)上，羅漢果以果實(shí)大小定價(jià)，以個(gè)數(shù)計(jì)效益；在提取加工中，則以果實(shí)重量來算收，因此，結(jié)果數(shù)、中大果比率和果實(shí)重量均為羅漢果產(chǎn)量構(gòu)成主要因素。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，施用微生物菌肥能促進(jìn)羅漢果結(jié)果，結(jié)果數(shù)隨著施肥水平的提高而增大，以T4最高，顯著高于其他處理，與對(duì)照相比結(jié)果數(shù)提高37.6%。單果重也有隨著施肥水平的提高而增大，以T4處理為最大；其次為T3處理，T4和T3之間差異不顯著，但均顯著高于T2、T1處理；與對(duì)照相比，增加幅度達(dá)到24.4%。中大果比率隨著肥料水平的提高呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，以T3處理最高，與對(duì)照相比提高12.9%。其次為T4處理，兩者之間差異不顯著，但均顯著高于其他處理?？梢钥闯?，微生物菌肥能增加羅漢果結(jié)果數(shù)和果實(shí)重量，一定施用水平能提高中大果比率。

硒是人體必需的微量元素，是人體抗氧化酶和硒蛋白的重要組成部分［12］，具有抗脂質(zhì)過氧化、保護(hù)生物膜、抗肝損傷的作用［13］，同時(shí)有提高人體免疫力和抗病毒感染的能力，在防治克汀病、心腦血管疾病、癌癥、肝病、糖尿病等方面均有較好的療效［14-15］。富硒羅漢果對(duì)肝臟具有較好的保護(hù)作用，綜合保健功能較好，倍受當(dāng)今消費(fèi)者的青睞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，施用本試驗(yàn)自主研制的改良型微生物菌肥，能顯著促進(jìn)羅漢果對(duì)硒的富集，富集量隨著施肥水平的提高而增加，以T4最高，其硒含量達(dá)到1.02 mg/kg，是對(duì)照的18倍，產(chǎn)品均符合《富硒農(nóng)產(chǎn)品硒含量分類要求》［16］之中藥材的要求，該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定富硒中藥材含硒應(yīng)為0.15～2.0 mg/kg。

3 討論

表3 微生物菌肥對(duì)羅漢果果實(shí)產(chǎn)量和硒含量的影響

根結(jié)線蟲病是一類危害大、分布廣、防治難的植物病蟲害，其發(fā)生是造成作物減產(chǎn)的直接原因，也是土壤質(zhì)地變差，引發(fā)連作障礙的重要表征。以往高毒、高殘留的防治方法，嚴(yán)重阻礙了“綠色”農(nóng)業(yè)的發(fā)展。尋找環(huán)境友好型的根結(jié)線蟲病防控技術(shù)是發(fā)展有機(jī)農(nóng)業(yè)的必經(jīng)之路。利用植物源活性物質(zhì)防治植物寄生線蟲的研究逐漸受到重視和廣泛關(guān)注［17］，已有研究報(bào)道稱，許多植物對(duì)南方根結(jié)線蟲有毒殺作用［18］。本試驗(yàn)中，使用的微生物菌肥以桐麩、油茶麩和蓖麻籽粉為基礎(chǔ)物質(zhì)，含有生物堿、蓖麻毒蛋白和茶籽醇成分，對(duì)南方根結(jié)線蟲病有明顯的抑制作用，與前人［19-21］的研究結(jié)果相一致，也驗(yàn)證，有機(jī)肥料本身或在腐解過程中產(chǎn)生有毒的次生代謝物質(zhì)，可致使土壤病原物死亡［22］。

人為添加的有益菌能快速培養(yǎng)形成優(yōu)勢(shì)菌群，直接致使土壤病原物死亡［23］，且能改變土壤微生物的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微生物間競(jìng)爭(zhēng)、捕食關(guān)系加劇，對(duì)土傳病原物起到競(jìng)爭(zhēng)和拮抗的作用［24］。此外，某些生物菌之間存在著協(xié)同作用［25］，加強(qiáng)了菌功能的作用效應(yīng)。本試驗(yàn)中，主要有益生物菌長柄平菇菌（Plurotusspodoleucus）和枯草芽孢桿菌（B．subtilis）協(xié)同作用，增強(qiáng)生物菌對(duì)羅漢果生長和根結(jié)線蟲病的抑制作用，與蔣妮［26］、丁國春［27］等研究結(jié)果相同。

利用功能性植物和微生物菌搭配制作而成的微生物菌肥，不僅能能植物本身活性成分或腐解過程分泌的有毒物質(zhì)與功能微生物菌共同作用以抑制南方根結(jié)線蟲，又能為作物生長提供養(yǎng)分，改善土壤環(huán)境，活化肥素，促進(jìn)作物生長，對(duì)羅漢果高質(zhì)量生產(chǎn)具有十分重要的意義。