彭宇晗, 程金龍, 葛金山, 朱元召*, 路振香, 張 濤, 姜玫宏

( 1.安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100;2.江蘇優(yōu)仕生物科技發(fā)展有限公司，江蘇 宿遷 223831; 3.山東眾成飼料科技有限公司，山東 肥城 271600)

熱應(yīng)激嚴(yán)重影響畜禽生產(chǎn)性能、代謝、免疫和繁殖性能，顯著降低家禽小腸淀粉酶活性和空腸淋巴細(xì)胞與漿細(xì)胞數(shù)量，通過糖皮質(zhì)激素使脂肪組織分解減少，從而產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損。目前，在飼料中添加如抗應(yīng)激劑等功能性添加劑以促進(jìn)蛋雞營養(yǎng)物質(zhì)代謝和增強(qiáng)免疫及抗氧化功能，已成為改善蛋雞抗熱應(yīng)激的主要營養(yǎng)技術(shù)手段，但對高代謝的無汗腺產(chǎn)蛋期蛋雞，這些抗熱應(yīng)激營養(yǎng)措施存在高成本、低效果等問題。因此，尚需要尋找更為有效的營養(yǎng)手段以降低熱應(yīng)激帶來的產(chǎn)業(yè)損失。

γ-氨基丁酸(GABA)又稱氨酪酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo) 40% 以上的抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)，能改善腦機(jī)能、增強(qiáng)記憶力、抗焦慮、鎮(zhèn)痛等。研究發(fā)現(xiàn)，GABA能減緩畜禽熱應(yīng)激，降低熱應(yīng)激雞體溫從而增加采食量；影響直腸溫度，促進(jìn)熱應(yīng)激黃羽肉雞生長和改善腸道結(jié)構(gòu)；改善肉仔雞生產(chǎn)性能和血液指標(biāo)。然而在畜禽日糧中應(yīng)用的GABA多為人工合成，成本較高。近幾年，篩選產(chǎn)GABA有益菌引起關(guān)注，Komatsuzaki等首次分離得到一株高產(chǎn)GABA真菌，此后篩選高產(chǎn)GABA菌株并濃縮純化GABA用于商業(yè)生產(chǎn)。若篩選并應(yīng)用能分泌高活性天然GABA的功能性有益菌，則不需提純GABA，可發(fā)揮有益菌與所產(chǎn)GABA的雙重抗熱應(yīng)激作用，不僅安全高效又經(jīng)濟(jì)方便。乳酸菌(

Lactobacillus

)是動物機(jī)體腸道內(nèi)存在的宿主優(yōu)勢型有益菌，自然界存在的乳酸菌所能分泌的GABA量很少或不分泌，有關(guān)產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選及其在蛋雞熱應(yīng)激中的應(yīng)用研究較為少見。為此，本研究選用前期自主篩選得到1株產(chǎn)GABA乳酸菌，研究其對熱應(yīng)激蛋雞產(chǎn)蛋性能和相關(guān)血清指標(biāo)的影響，旨在為功能性有益菌的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

產(chǎn)GABA乳酸菌由安徽科技學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料學(xué)教研室自豬糞便中自主分離得到，該菌株已于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，登記入冊編號為CGMCC No.8538；產(chǎn)GABA乳酸菌干粉由產(chǎn)GABA乳酸菌培養(yǎng)液冷凍干燥制成，含乳酸菌活菌4×10CFU/g。植物乳桿菌由山東眾成飼料科技有限公司提供，活菌含量為2×10CFU/g。GABA標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。

1.2 試驗動物、日糧和飼養(yǎng)管理

選取40周齡、體重相近的健康海蘭(Hy-Line)褐殼蛋雞共1 080只，采用單因子完全隨機(jī)試驗設(shè)計，分為4個處理組，每組3個重復(fù)，每重復(fù)90只雞。試驗基礎(chǔ)日糧為由5%蛋雞產(chǎn)蛋期復(fù)合預(yù)混合飼料和玉米、麩皮、豆粕、石粉組成的全價配合日糧，其中不含小蘇打等抗應(yīng)激劑，不含益生菌。對照組A僅飼喂基礎(chǔ)配合日糧；陽性對照組B在基礎(chǔ)日糧中添加50 mg/kg的GABA標(biāo)準(zhǔn)品；試驗組C、D分別在基礎(chǔ)日糧中添加相當(dāng)于含50 mg/kg GABA的產(chǎn)GABA乳酸菌干粉劑143、300 mg/kg植物乳桿菌。試驗日糧及營養(yǎng)組成見表1，5%蛋雞產(chǎn)蛋期復(fù)合預(yù)混合飼料組成見表2。

表1 蛋雞產(chǎn)蛋期飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 5%蛋雞產(chǎn)蛋期復(fù)合預(yù)混合飼料組成

試驗前對雞舍進(jìn)行帶雞消毒，試驗雞采用三階式籠養(yǎng)，每籠3只，每日飼喂2次。所有處理組均以重復(fù)為單位，隨機(jī)相隔排列，以減少環(huán)境條件差異所引起的誤差。試驗自40 周齡始，預(yù)飼1周，正式試驗自41周齡到48 周齡。蛋雞自由采食、飲水，采用自然光和人工補(bǔ)光達(dá)16 h/d光照。試驗期，每天分別于08:00、14:00、20:00測量蛋雞舍溫度，3次測定溫度平均值為(28.83±3.85) ℃(成年蛋雞生產(chǎn)的適宜溫度為18～21 ℃)，試驗期中午舍內(nèi)最高溫度有時達(dá)35 ℃；相對濕度為37.2%～53.9%。上述溫度和濕度條件對產(chǎn)蛋雞產(chǎn)生一定程度的熱應(yīng)激。做好日常舍內(nèi)通風(fēng)換氣，定期清糞。

(2) 蛋雞維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供VA 10 000 IU，VD3 100 IU，VE 18 mg，VK2.5 mg，VB2.0 mg，VB6.0 mg，VB3.6 mg，VB19 mg，煙酸27.0 mg，D-泛酸12.0 mg，葉酸0.8 mg，生物素130 mg。

1.3 產(chǎn)蛋性能測定

試驗期每天喂料2次，按重復(fù)記錄采食量、產(chǎn)蛋總數(shù)和總蛋重，以組為單位分別統(tǒng)計與計算試驗1～4、5～8、1～8周蛋雞的平均日采食量、產(chǎn)蛋率、平均蛋重、日產(chǎn)蛋重和料蛋比。

1.4 血樣采集與制備

在試驗第4周末和試驗結(jié)束第8周末分別空腹采集各組血液樣品，每個重復(fù)隨機(jī)取3只健康蛋雞，靜脈采血5 mL注入促凝血管，于4 ℃恒溫離心機(jī)中。3 500 r/min離心15 min，離心結(jié)束后分離血清，分裝保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.5 血清指標(biāo)測定

1.5.1 血清酶 血清乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、肌酸磷酸激酶(CPK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)含量均采用購自南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定，試劑配制和操作步驟均按說明書進(jìn)行。

1.5.2 血清免疫球蛋白 血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)采用快速免疫比濁法測定，所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所，試劑配制和操作步驟均按說明書進(jìn)行。

1.5.3 血清抗體水平 血清禽流感病毒H9、H5-5、H5-4和新城疫病毒抗體水平按照《高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范》規(guī)定的方法，對血清樣品進(jìn)行血凝抑制效價測定，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 20.0單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用鄧肯氏法(Duncan)多重比較進(jìn)行檢驗，其中

P>

0.05為差異不顯著，

P<

0.05為差異顯著，

P<

0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響

由表3可知，在試驗1～4周，與對照組A相比，陽性對照組B、試驗組C、D蛋雞產(chǎn)蛋率分別降低0.39%(

P

>0.05)、提高1.86%(

P

<0.05)和1.58%(

P

<0.05)；C、D組間無顯著差異(

P

>0.05)。在試驗5～8周，陽性對照組B、試驗組C和D組產(chǎn)蛋率較對照組A分別提高1.50%(

P

<0.05)、1.57%(

P

<0.05)和0.67%(

P

>0.05)。在試驗1～8周，與對照組A相比，陽性對照組B、試驗組C和D組產(chǎn)蛋率分別降低0.02%(

P

>0.05)、提高1.47%(

P

<0.05)、0.88%(

P

>0.05)；C、D組間無顯著差異(

P

>0.05)；C組較B組產(chǎn)蛋率顯著提高(

P

<0.05)。

表3 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響

在試驗1～4周，D組蛋重最高。在試驗5～8周，B、C、D組蛋重均顯著高于對照組A(

P

<0.05)。在試驗1～8周，試驗組D蛋重較對照組A提高0.35%(

P

<0.05)，B、C和D組間蛋重?zé)o顯著差異(

P

>0.05)。在試驗1～4、5～8、1～8周，對照組A、陽性對照組B、試驗組C、D蛋雞采食量較為接近，各組間均無顯著差異(

P

>0.05)。在試驗1～4周，陽性對照組B、試驗組C和D組蛋雞料蛋比較對照組A分別降低0.78%(

P

>0.05)、4.37%(

P

>0.05)、4.51%(

P

<0.05)，B、C、D組間無顯著差異(

P

>0.05)。在試驗5～8周，D組料蛋比最低，但各組間無顯著差異(

P

>0.05)。在試驗1～8周，試驗C、D組料蛋比均顯著低于陽性對照組B(

P

<0.05)，但與對照組間無顯著差異(

P

>0.05)。

2.2 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞血清酶活性的影響

由表4可知，在試驗第4周末，與對照組A相比，陽性對照組B、試驗組C和D組蛋雞血清堿性磷酸酶(AKP)活性分別降低6.54%(

P

>0.05)、25.10%(

P

<0.05)、4.28%(

P

>0.05)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性分別降低14.41%(

P

>0.05)、12.22%(

P

>0.05)、19.53%(

P

<0.05)；乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸磷酸激酶(CPK)均降低，但未見顯著差異(

P

>0.05)。與B、D組相比，添加產(chǎn)GABA乳酸菌的C組血清AKP活性分別降低29.29%、28.17%，差異均顯著(

P

<0.05)。

表4 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞血清酶活性的影響

在試驗第8周末，與對照組A相比，陽性對照組B、試驗組C、D的堿性磷酸酶(AKP)分別降低21.08%(

P

>0.05)、24.20%(

P

<0.05)、20.88%(

P

>0.05)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)分別降低2.68%(

P

>0.05)、16.22%(

P

<0.05)、10.38%(

P

>0.05)。與B、D組相比，添加產(chǎn)GABA乳酸菌的C組血清GPT活性分別降低13.92%、6.52%，差異均顯著(

P

<0.05)。B、C、D組間血清LDH、CPK、AKP活性均無顯著差異(

P

>0.05)。

2.3 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞免疫球蛋白水平的影響

由表5可知，在試驗第4周末，與對照組A相比，陽性對照組B、試驗組C、D免疫球蛋白A(IgA)分別提高5.99%(

P

>0.05)、39.52%(

P

<0.05)、5.39%(

P

>0.05)；免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)均有提高，但差異均不顯著(

P

>0.05)。與B、D組相比，添加產(chǎn)GABA乳酸菌的C組血清IgA活性分別提高31.64%、32.39%，差異均顯著(

P

<0.05)。

表5 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞血清免疫球蛋白水平的影響

在試驗第8周末，與對照組A相比，陽性對照組B、試驗組C、D血清IgA、IgM、IgG水平均有上升，但差異均不顯著(

P

>0.05)。

2.4 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞抗體水平的影響

由表6可知，在試驗第4周末，與對照組A相比，陽性對照組B、試驗組C、D血清禽流感病毒H5-5抗體水平分別提高5.30%(

P

>0.05)、6.60%(

P

>0.05)、12.34%(

P

<0.01)，B、C、D組間血清禽流感病毒H5-5抗體水平無顯著差異(

P

>0.05)。與對照組A相比，禽流感病毒H9抗體、新城疫病毒(ND)抗體、禽流感病毒H5-4抗體水平均有提高趨勢，但均未見顯著差異(

P

>0.05)。

表6 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞血清抗體水平的影響

在試驗第8周末，與對照組A相比，陽性對照組B、試驗組C、D血清禽流感病毒H5-5抗體水平分別提高4.55%(

P

<0.01)、1.11%(

P

<0.05)、0.22%(

P

>0.05)；ND抗體水平分別提高1.29%(

P

<0.05)、0.17%(

P

>0.05)、0.17%(

P

>0.05)，試驗組D禽流感病毒H5-5抗體水平較陽性對照組B下降4.14%，差異極顯著(

P

<0.01)。A、B、C、D各組間血清禽流感病毒H9抗體水平、禽流感病毒H5-4抗體水平均無顯著差異(

P

>0.05)。

3 討論

3.1 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響

Al-Harthi研究表明，高溫能導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞采食量、飼料利用率等產(chǎn)蛋性能下降，其機(jī)制是高溫影響了消化酶活性；Zhang等報道GABA主要通過增加熱應(yīng)激蛋雞胃腸道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性，從而減緩蛋雞熱應(yīng)激，調(diào)節(jié)蛋雞采食量和改善營養(yǎng)物質(zhì)利用率。本研究添加50 mg/kg純品GABA對蛋雞產(chǎn)蛋性能影響不顯著，與上述研究不一致，而添加300 mg/kg植物乳桿菌、產(chǎn)GABA乳酸菌分別顯著提高了熱應(yīng)激蛋雞蛋重和產(chǎn)蛋率，提示調(diào)節(jié)消化道菌群平衡的有益菌較GABA緩解蛋雞熱應(yīng)激作用強(qiáng)；產(chǎn)GABA乳酸菌顯著提高產(chǎn)蛋率和趨勢性增加蛋重、改善飼料利用率，提示兼具有益菌和GABA的雙效性作用。

3.2 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞血清酶活性的影響

乳酸脫氫酶(LDH)存在于幾乎所有機(jī)體組織，以肝、腎、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中為最多，這些組織中LDH含量比血清中多, 因此當(dāng)少量組織壞死時, 該酶就會釋放入血而使血液中的含量升高，醫(yī)學(xué)上將LDH作為常見傷害和疾病的標(biāo)記。研究表明，蛋雞在30～35 ℃熱應(yīng)激條件下，血清中LDH升高。本試驗中，未見添加GABA、產(chǎn)GABA乳酸菌、植物乳桿菌能降低血清LDH含量，這可能與本試驗環(huán)境溫度28.83 ℃對蛋雞產(chǎn)生熱應(yīng)激強(qiáng)度不大有關(guān)，因為當(dāng)舍內(nèi)環(huán)境溫度達(dá)32.00 ℃以上時，蛋雞熱應(yīng)激癥狀明顯，相關(guān)血清生理生化指標(biāo)會發(fā)生顯著變化。

肌酸磷酸激酶(CPK)是催化肌酸轉(zhuǎn)化并消耗三磷酸腺苷(ATP)生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷(ADP)的一種氧化酶。肌肉損傷時機(jī)體會分泌大量的CPK來修復(fù)損傷的肌肉，因此血清CPK常被作為肌肉損傷的指示指標(biāo)。血清CPK含量越低，肌肉損傷程度也就越低。研究顯示在處于熱應(yīng)激狀態(tài)下，肉雞機(jī)體內(nèi)肌酸磷酸激酶含量顯著升高。本試驗未見添加GABA、產(chǎn)GABA乳酸菌、植物乳桿菌能降低血清CPK值，其原因是否與熱應(yīng)激嚴(yán)重程度有關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

堿性磷酸酶(AKP)能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，生成磷酸根離子和自由的羥基。當(dāng)肝臟受到損傷或者障礙時，AKP含量會升高。研究表明，在熱應(yīng)激狀態(tài)下，肉仔母雞AKP、CPK和LDH含量都顯著升高。本試驗發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加50 mg/kg GABA和300 mg/kg植物乳桿菌8周后均有降低蛋雞血清AKP含量趨勢，產(chǎn)GABA乳酸菌則能顯著降低AKP含量；在試驗第4周后，產(chǎn)GABA乳酸菌組較對照組、GABA組和植物乳桿菌組血清AKP均顯著降低，而試驗第8周末，產(chǎn)GABA乳酸菌組AKP較GABA組、植物乳桿菌組高，但無顯著差異，這提示產(chǎn)GABA乳酸菌對熱應(yīng)激所致的蛋雞肝損傷具有保護(hù)作用，并在熱應(yīng)激早期的這種保護(hù)作用好于單一添加GABA或植物乳桿菌。

研究表明，夏季熱應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體酶水平的改變。動物受熱時，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、LDH、CPK活性上升。GPT是反應(yīng)肝臟功能的重要指標(biāo)，參與體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用，反映蛋白質(zhì)合成和代謝狀況。GPT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，在肝細(xì)胞損傷或細(xì)胞通透性增強(qiáng)時，該酶滲入血液，血中酶活性顯著增高。GPT活性可反應(yīng)肝細(xì)胞損傷程度。對崇仁麻雞的研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加GABA顯著降低血清GPT活性。本研究中，在日糧中添加50 mg/kg GABA和300 mg/kg植物乳桿菌8周后均有降低蛋雞血清GPT趨勢，產(chǎn)GABA乳酸菌組較對照組、GABA組和植物乳桿菌組均顯著降低GPT含量，推測產(chǎn)GABA乳酸菌所分泌的GABA與乳酸菌具有雙重疊加功效，較添加GABA和不產(chǎn)GABA的植物乳桿菌對蛋雞肝臟產(chǎn)生的保護(hù)作用更強(qiáng)。

3.3 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞免疫球蛋白的影響

GABA具有抗應(yīng)激作用。GABA抑制應(yīng)激對腎上腺分泌機(jī)能的激活，進(jìn)而減輕腎上腺糖皮質(zhì)激素上升引起的免疫抑制；促進(jìn)甲狀腺激素分泌，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成并提高基礎(chǔ)代謝；GABA還能通過抑制生長抑素(SS)的分泌，消除SS對免疫的抑制作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。研究表明，人口服100 mg/kg GABA后唾液中免疫球蛋白(IgA)的分泌水平顯著提高，從而增強(qiáng)機(jī)體抵御病原侵入，提高機(jī)體免疫力；在斷奶仔豬日糧中添加30 mg/kg GABA可顯著增強(qiáng)體內(nèi)免疫功能作用；給綿羊灌服GABA可增強(qiáng)生長期羔羊機(jī)體免疫性能；日糧中添加100 mg/kg GABA顯著增強(qiáng)熱應(yīng)激狀態(tài)下黃羽肉雞的免疫功能。本試驗第4周末，產(chǎn)GABA乳酸菌較對照組、GABA組,植物乳桿菌能顯著提高免疫球蛋白IgA含量，與上述GABA在人、斷奶仔豬、綿羊、熱應(yīng)激黃羽肉雞對免疫性能影響的研究結(jié)果較為一致，僅GABA含量不同。本試驗第4周末添加50 mg/kg GABA并未較對照組血清IgA有顯著提高，這可能由于GABA添加量較低所致。而產(chǎn)GABA乳酸菌組的GABA含量雖為50 mg/kg，但乳酸菌為機(jī)體有益菌，也可能因有益菌作用機(jī)制如誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素與白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子、通過淋巴循環(huán)活化全身免疫防御系統(tǒng)等增強(qiáng)機(jī)體免疫力，因此推測產(chǎn)GABA乳酸菌提高蛋雞血清IgA含量是GABA和乳酸菌雙重疊加作用所致。本試驗第8周末，各組間蛋雞血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)無顯著不同，這可能與本試驗舍內(nèi)溫度雖超過蛋雞機(jī)體最適體溫上限而造成的熱應(yīng)激強(qiáng)度不大有關(guān)，因為熱應(yīng)激對免疫系統(tǒng)影響十分復(fù)雜，急性應(yīng)激反應(yīng)可增強(qiáng)免疫，持續(xù)強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)則能抑制免疫系統(tǒng)。

3.4 產(chǎn)GABA乳酸菌對蛋雞抗體水平的影響

本試驗第8周末，與對照組相比，蛋雞日糧中添加50 mg/kg GABA、產(chǎn)GABA乳酸菌分別能極顯著、顯著提高血清禽流感病毒H5-5抗體水平，50 mg/kg GABA能顯著提高血清新城疫病毒(NDV)抗體水平，這與李麗等研究的GABA和植物提取物可提高肉雞新城疫抗體水平的結(jié)果較為一致。GABA可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使機(jī)體中更多淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，從而產(chǎn)生抗體，延緩抗體水平降低。本試驗各組間禽流感病毒H5-4、H9抗體水平無顯著不同，尚不清楚GABA對禽流感病毒不同亞型抗體水平產(chǎn)生不同影響是否有關(guān)。

4 結(jié)論

在蛋雞日糧中添加相當(dāng)于50 mg/kg GABA的產(chǎn)GABA乳酸菌，能顯著提高蛋雞產(chǎn)蛋率，降低熱應(yīng)激蛋雞血清堿性磷酸酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，提高血清免疫球蛋白IgA含量和禽流感病毒H5-5抗體水平。產(chǎn)GABA乳酸菌提高產(chǎn)蛋率、保護(hù)蛋雞肝功能正常和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能與產(chǎn)GABA乳酸菌的有益菌及所分泌抗應(yīng)激活性成分GABA的雙重功效有關(guān)。