史正文

摘? ? 要：為篩選出野生小葉黑柴胡種子的最佳萌發(fā)條件，以種子萌發(fā)得到的小葉黑柴胡下胚軸為外植體，探討了不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基和不同濃度外源性激素在愈傷組織、不定根形成中的作用，以便對(duì)野生小葉黑柴胡種質(zhì)資源的保護(hù)提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：野生小葉黑柴胡;種子萌發(fā);組織培養(yǎng)

文章編號(hào)： 1005-2690（2021）06-0010-02? ? ? ?中國(guó)圖書分類號(hào)： S567.79? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

小葉黑柴胡植株矮小，高僅15～40 cm;根呈黑褐色、小而多分枝，莖叢生;葉窄而小，花呈傘形且花序小，種子小且發(fā)芽率低[1]。藥理研究表明，小葉黑柴胡性苦、微寒，具有解熱、抗病毒、抗炎等作用[2]。小葉黑柴胡主要分布在海拔2 700～3 700 m的地區(qū)[3]，由于過(guò)度采挖，野生資源逐漸枯竭。采用組培育苗繁殖快，種苗質(zhì)量高。因此，建立野生小葉黑柴胡組培育苗體系，對(duì)其資源保護(hù)具有一定的指導(dǎo)意義。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

當(dāng)年野生小葉黑柴胡種子，采自山西省寧武縣山區(qū)。

1.2? ?試劑

生長(zhǎng)素：激動(dòng)素（KT）、萘乙酸（NAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）。

消毒劑：75% Alcohol、0.1% HgCl2、2% NaClO3。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MS和B5培養(yǎng)基，水解酪蛋白（CH）。

1.3? ?培養(yǎng)條件

以MS和B5為基本培養(yǎng)基，通過(guò)改變激素種類和濃度形成不同條件的培養(yǎng)基。pH值6.0～6.5，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度50 μmol/（m2·s），溫度（26±2）℃。

1.4? ?試驗(yàn)方法

1.4.1? ?小葉黑柴胡種子萌發(fā)的條件

1.4.1.1? ? 不同溫度下的萌芽試驗(yàn)

取野生小葉黑柴胡種子400粒，每100粒分別在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃溫度下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，逐日記錄發(fā)芽數(shù)，30 d后計(jì)算發(fā)芽率。本試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.1.2? ? 不同試劑浸種的發(fā)芽試驗(yàn)

取小葉黑柴胡種子200粒，每100粒分別用3% H2O2、1.0 mg/L GA3浸種1 d，再用流水洗凈。逐日記錄發(fā)芽數(shù)，30 d后計(jì)算發(fā)芽率。

1.4.2? ?小葉黑柴胡愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)

1.4.2.1? ? 試驗(yàn)材料的消毒

取實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出的小葉黑柴胡幼苗，分別用75% Alcohol、0.1% HgCl2、2% NaClO3 消毒劑浸泡，篩選最佳的消毒條件。

1.4.2.2? ? 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將消毒后的幼苗，用無(wú)菌水沖洗3次，選取下胚軸，切成1 cm小段接種于不同激素配比的MS或B5基本培養(yǎng)基表面。

試驗(yàn)中每30 d繼代1次，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率，記錄愈傷組織的顏色、質(zhì)地及生長(zhǎng)狀況。最后根據(jù)數(shù)據(jù)分析，篩選出最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.4.2.3? ? 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將下胚軸生成的愈傷組織取出，用滅菌解剖刀切成小塊，無(wú)菌水沖洗干凈，然后接入含有不同濃度的激素和水解酪蛋白CH的MS或B5基本培養(yǎng)基表面，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?小葉黑柴胡種子的萌發(fā)條件篩選

對(duì)于柴胡種子發(fā)芽率低的原因，魏建和等[4]曾報(bào)道，柴胡種子萌發(fā)率低與種皮和種子的成熟度有關(guān)。本試驗(yàn)采取不同溫度及不同化學(xué)試劑對(duì)野生小葉黑柴胡種子進(jìn)行預(yù)處理，探討了小葉黑柴胡種子的發(fā)芽條件，結(jié)果見表1和表2。

由表1和表2可以看出，用3%H2O2浸種1 d，能使小葉黑柴胡種子的發(fā)芽率顯著提高，而1.0 mg/L GA3對(duì)小葉黑柴胡種子的發(fā)芽有抑制作用。小葉黑柴胡種子發(fā)芽的最適溫度為20 ℃，其中15～20 ℃時(shí)的發(fā)芽率要高于25～30 ℃，說(shuō)明小葉黑柴胡種子發(fā)芽喜低溫。

2.2? ?滅菌方法的比較

組培育苗中首先要解決的問(wèn)題是污染，如果不能控制污染，組培育苗就失去了意義。因此，探索外植體的最佳消毒條件是小葉黑柴胡組織培養(yǎng)的前提。本次試驗(yàn)比較了4種消毒方法，選擇出了殺傷力較小且效果好的消毒方案。接種10 d后，4種不同消毒方案的效果見表3。

由表3可以看出，用方案3和4消毒，滅菌效果雖然好，但對(duì)外植體的損害也大，獲得的無(wú)菌試驗(yàn)材料存活率也低。因此，在選擇消毒劑時(shí)，既要考慮能殺死附著在外植體表面的微生物，又要盡量不傷害植物組織細(xì)胞。用方案1消毒，存活率高，但污染率也很高;而用方案2消毒，污染率很低，同時(shí)存活率也很高。所以，小葉黑柴胡的最佳消毒條件是75% Alcohol溶液中蕩滌30 s，無(wú)菌水蕩滌后，用0.1% HgCl2溶液蕩滌2.5 min，無(wú)菌水蕩滌后，再用2% NaClO3溶液蕩滌10 min。

2.3? ?愈傷組織誘導(dǎo)條件

由表4可知，不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、不同濃度外源性激素對(duì)小葉黑柴胡下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果不同。整體來(lái)看，培養(yǎng)7 d后，野生小葉黑柴胡下胚軸開始形成愈傷組織。其中，MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織的效果優(yōu)于B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基，0.1 mg/L KT的誘導(dǎo)效果優(yōu)于0.5 mg/L KT。2，4-D是柴胡組織愈傷組織誘導(dǎo)的主要激素，在MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT的培養(yǎng)基上，下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到100%，并且生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

2.4? ?不定芽的誘導(dǎo)條件

在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d左右，下胚軸愈傷組織塊上開始分化出芽，且分化出芽的數(shù)量逐天增加，具體結(jié)果見表5。

由表5可以看出，在B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一定量的6-BA、NAA和CH，有利于小葉黑柴胡下胚軸愈傷組織分化芽，并且1.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+250 mg/L CH的B5培養(yǎng)基分化率最高。

3? ?討論

試驗(yàn)表明，下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基是：MS為基本培養(yǎng)基，添加的激素及濃度分別為1.0 mg/L 2，4-D、0.1 mg/L KT。不定芽分化的最適培養(yǎng)基是：B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加的激素及濃度分別為1.5 mg/L 6-BA、0.02 mg/L NAA、250 mg/L CH。

組培育苗時(shí)，外植體的采集會(huì)受時(shí)間、種植地點(diǎn)的限制，尤其是超過(guò)了適宜采集期，外植體培養(yǎng)的愈傷組織質(zhì)量就會(huì)受到影響。因此，本試驗(yàn)采集當(dāng)年野生小葉黑柴胡飽滿、無(wú)病蟲害的種子。組培試驗(yàn)中，外植體消毒效果的好壞會(huì)影響組培育苗的成活率。首先，在實(shí)驗(yàn)室探索其種子發(fā)芽的適宜條件，提高了其種子的發(fā)芽率。其次，在溫室中種植，得到其幼苗，為下一步的組培育苗提供了優(yōu)良的外植體。本試驗(yàn)篩選出了野生小葉黑柴胡外植體的最佳消毒方法，保障了后續(xù)組培育苗的成功。本試驗(yàn)選用小葉黑柴胡的下胚軸作為組培育苗的外植體，由下胚軸形成的愈傷組織顏色為淺綠色，質(zhì)地松軟，生長(zhǎng)良好，并且分化能力強(qiáng)，提高了組培育苗的效率。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 胡雙豐.柴胡與其混淆品小葉黑柴胡及錐葉黑柴胡的鑒別[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2006，24（4）：47-48.

[ 2 ] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[ 3 ] 王玉慶，牛顏冰，秦雪梅.野生柴胡資源調(diào)查[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，27（1）：103-107.

[ 4 ] 魏建和，李昆同，程惠珍.種子成熟度及種皮對(duì)北柴胡和三島柴胡種子萌發(fā)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2003，31（5）：46-48.