陳錦芬，顧開元，賈雨豪，成欣，鄒聰明，謝小玉*

1 西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶北碚 400715；

2 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南昆明 650021

錳是作物生長(zhǎng)所必須的重要元素之一，它參與了植物的光合作用、氧化還原反應(yīng)及多種酶代謝過程[1]。但是，高錳脅迫下容易引發(fā)植物體內(nèi)的一系列危害，包括植株生物量減少[2]，種子發(fā)芽率降低[3]，礦質(zhì)元素吸收、光合系統(tǒng)[4]及抗氧化酶系統(tǒng)[5]紊亂。因此，高錳脅迫成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要限制因素。煙草是我國(guó)西南地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物，該地區(qū)多為酸性土壤，部分地區(qū)有效錳含量極豐富，易引起錳過量癥[6]。已有研究表明，錳過量脅迫會(huì)引起生理性中毒，并最終對(duì)烤煙外觀質(zhì)量與內(nèi)在品質(zhì)造成不良影響[7]。因此減輕高濃度錳脅迫對(duì)植物的危害具有十分重要的意義。

已有研究表明，施加外源水楊酸[8]及甜菜堿[9]對(duì)植物重金屬脅迫有緩解作用。水楊酸是一種植物體內(nèi)重要的酚類物質(zhì)，施加外源水楊酸可以提高植物的抗逆能力[10]。外源水楊酸可以促進(jìn)NaCl脅迫下葉片中光合色素的合成，從而促進(jìn)了葉片光合作用[11]；王小紅等[8]研究發(fā)現(xiàn)施加外源水楊酸可以顯著提高鎘脅迫下抗氧化酶的活性，并顯著降低鎘脅迫下對(duì)抗氧化酶活性的抑制作用；張曉等[12]認(rèn)為，水楊酸可以促進(jìn)鎘脅迫下幼苗的生長(zhǎng)并降低鎘在其體內(nèi)的積累。

甜菜堿是一種滲透保護(hù)劑，它廣泛存在于動(dòng)植物體中，可幫助植物抵御逆境帶來的傷害[13]。根施外源甜菜堿可以提高胡楊葉片的耐鹽力；在對(duì)煙草的研究中也發(fā)現(xiàn)，甜菜堿可以降低其對(duì)鎘的吸收及積累，從而減緩鎘的毒害作用[14]。

目前，已有許多關(guān)于外源物質(zhì)對(duì)煙草鎘脅迫的緩解的研究，但是對(duì)于錳脅迫的研究還未見報(bào)道。因此，本研究以煙草紅花大金元為試驗(yàn)材料，采用盆栽試驗(yàn)方法探究高錳脅迫對(duì)煙草生理特性的影響及外源水楊酸、甜菜堿對(duì)煙草抗氧化系統(tǒng)及錳積累的影響，以期探明煙草生產(chǎn)中錳脅迫緩解的生理機(jī)制及緩解錳脅迫的最適水楊酸和甜菜堿濃度，為解決生產(chǎn)中煙草錳脅迫問題提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019 年4 月至8 月在西南大學(xué)2 號(hào)溫室進(jìn)行。將煙草種子播種于育苗盤中，培養(yǎng)至4葉1心時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、無病害的煙苗移栽至裝有8 kg壤土的花盆中，按照常規(guī)方式供給水肥。盆底放置托盤以防根系伸出，待煙草長(zhǎng)至旺長(zhǎng)期時(shí)開始進(jìn)行脅迫處理。每處理三重復(fù)，每重復(fù)3盆，每盆留1株煙苗。于早上9：00～ 10：00對(duì)每盆煙苗根灌以MnSO4·H2O配成的Mn2+含量為500 mg/kg（根據(jù)前人研究結(jié)果與前期預(yù)備試驗(yàn)篩選）的水溶液1L，對(duì)照組（CK）以等量蒸餾水代替，共澆灌3次，每?jī)纱沃g間隔一周；在第3次脅迫處理后的第3天，開始進(jìn)行緩解處理（在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上分別篩選出4個(gè)濃度梯度），即在每天早上9：00～ 10:00分別根灌水楊酸（SA）和甜菜堿（GB）溶液200 mL，對(duì)照（CK）及錳脅迫對(duì)照（CK1）根灌等量蒸餾水。每天1次，共澆3天，3天后取自上而下第4～6片葉剪碎混勻用以測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組方法，共有10個(gè)處理，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab. 1 Test design

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 最大葉長(zhǎng)葉寬測(cè)定

1.2.2 錳含量測(cè)定

取部分混勻后的葉片，置105℃的烘箱中殺青30分鐘后于80℃中烘至恒重。然后用粉碎機(jī)粉碎過0.2 mm篩。稱取0.5 g樣品加入7.5 mL濃硝酸和1.5 mL高氯酸，混勻后進(jìn)行消解，得到白色透明的消化液后用去離子水洗入50 mL容量瓶并定容，使用原子分光光度儀（AA7000，島津）測(cè)定錳含量[16]。

1.2.3 生理指標(biāo)測(cè)定

稱取部分混勻后的葉片0.2 g剪碎，置于20 mL去離子水中，真空抽提2～3次，在20℃～25℃恒溫下用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率T1，測(cè)完再放入100℃沸水中水浴30 min，取出后自然冷卻至室溫測(cè)定煮后電導(dǎo)率T2，相對(duì)電導(dǎo)率（REC）= T1/ T2×100%。

在模塊化、定制化設(shè)備和服務(wù)中，存在大量可重復(fù)使用和重新組合使用的單元.通過采用標(biāo)準(zhǔn)化、系列化、通用化的方法,充分挖掘和利用這些單元,將定制設(shè)備的生產(chǎn)問題，通過設(shè)備重組和過程重組,全部或部分轉(zhuǎn)化為批量生產(chǎn)的問題,從而以較低的成本、較高的質(zhì)量和較快的速度生產(chǎn)出個(gè)性化設(shè)備.

丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）及過氧化氫酶（CAT）活性分別采用氮藍(lán)四唑法、愈創(chuàng)木酚法及紫外吸收法測(cè)定；可溶性蛋白（SP）、可溶性糖（SS）和脯氨酸（Pro）含量分別采用考馬斯亮藍(lán)G-250法、蒽酮比色法和磺基水楊酸法測(cè)定[17-18]；過氧化氫（H2O2）及超氧陰離子產(chǎn)生效率采用試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司生產(chǎn)）測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Excel 2010和SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用鄧肯（Duncan’s）法進(jìn)行方差分析，采用皮爾遜（Pearson）法進(jìn)行相關(guān)性分析。采用隸屬函數(shù)值法對(duì)錳脅迫緩解程度進(jìn)行分析：當(dāng)外源緩解物質(zhì)的施用與該指標(biāo)測(cè)定值呈正相關(guān)時(shí)，選用公式：Z(i)=（Zi- Zmin）/（Zmax- Zmin），呈負(fù)相關(guān)時(shí)則選用公式：Z(i)=1-（Zi - Zmin）/（Zmax- Zmin）。式中：Z(i)為某系列指標(biāo)的隸屬值，Zi為某系列指標(biāo)的測(cè)定值，Zmax為該系列指標(biāo)測(cè)定的最大值，Zmin則是最小值，最后取所有指標(biāo)的平均值即為該處理的綜合評(píng)價(jià)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對(duì)煙草最大葉長(zhǎng)葉寬的影響

圖1表明，錳脅迫（CK1）下最大葉長(zhǎng)、葉寬均顯著降低。施加外源水楊酸及甜菜堿后最大葉長(zhǎng)的變化不明顯；經(jīng)外源緩解物質(zhì)處理后S2、S3的最大葉寬最大，較CK1分別增加了26.09%及28.26%，差異達(dá)到顯著水平。

圖1 不同處理對(duì)煙草葉片最大葉長(zhǎng)、葉寬的影響Fig. 1 Effect of different treatments on maximum length and width of tobacco leaves under manganese stress

2.2 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對(duì)煙草錳含量的影響

圖2表明，錳脅迫（CK1）下煙草葉片的錳含量增加了14.8倍。施加外源緩解物質(zhì)后的各處理葉片中的錳含量下降。其中G3和S2處理下的錳含量最低，即當(dāng)外源甜菜堿濃度為0.20 mol/L、外源水楊酸濃度為150 mg/L時(shí)，對(duì)煙草錳脅迫的緩解效果最好。

圖2 不同處理對(duì)煙草葉片錳含量的影響Fig. 2 Effect of different treatments on manganese content of tobacco leaves under manganese stress

2.3 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對(duì)煙草中相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量的影響

圖3表明，錳脅迫（CK1）下煙草葉片的相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量分別增加了115.74%和48.85%。相對(duì)于錳脅迫處理，施加外源物質(zhì)后二者均降低，其中G3處理和S2處理煙葉的相對(duì)電導(dǎo)率分別降低了25.50%和29.82%、丙二醛含量分別降低了29.92%及31.38%達(dá)到最低水平。

圖3 不同處理對(duì)煙草中相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量的影響Fig. 3 Effect of different treatments on relative electrical conductivity and MDA content of tobacco leaves under manganese stress

2.4 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對(duì)3個(gè)抗氧化酶活性的影響

圖4表明，錳脅迫（CK1）下煙草葉片的抗氧化酶活性均顯著提高，施加外源緩解物質(zhì)后活性受到抑制。當(dāng)外源甜菜堿濃度為0.20 mol/L時(shí)，SOD及CAT活性最低，POD則是在G4水平活性最低；當(dāng)外源水楊酸濃度為200 mg/L時(shí)，SOD及POD活性受到抑制的程度最大，而CAT活性在濃度為150 mg/L時(shí)最低，較CK1降低了34.46%，達(dá)到最低水平。

圖4 不同處理對(duì)煙草中抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effect of different treatments on antioxidant enzyme activity of tobacco leaves under manganese stress

2.5 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對(duì)可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量的影響

圖5表明，錳脅迫處理（CK1）會(huì)使?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加，施加外源物質(zhì)后下降。當(dāng)外源甜菜堿濃度為0.15 mol/L時(shí)，可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的下降幅度最大，分別降低了11.91%、43.28%及33.93%達(dá)到最低，與CK1差異顯著；三者的含量隨外源水楊酸濃度變化差異較大，其中可溶性蛋白在水楊酸濃度為100 mg/L時(shí)含量最低且呈現(xiàn)隨濃度升高含量逐漸上升的趨勢(shì)，可溶性糖含量在S4處理時(shí)含量達(dá)到最低，當(dāng)水楊酸濃度為150 mg/L時(shí)脯氨酸含量最低，較CK1顯著降低25.33%。

圖5 不同處理對(duì)煙草中可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的影響Fig. 5 Effects of different treatments on the contents of soluble protein, soluble sugar and proline in tobacco leaves under manganese stress

2.6 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對(duì)H2O2含量及O2-產(chǎn)生速率的影響

圖6表明，錳脅迫處理（CK1）使煙草葉片的過氧化氫含量及超氧陰離子產(chǎn)生效率顯著提高，施加外源物質(zhì)后則降低。當(dāng)外源甜菜堿濃度為0.25 mol/L時(shí)過氧化氫含量達(dá)到最低，不同濃度外源水楊酸處理下，過氧化氫含量差異不顯著；施加外源物質(zhì)后超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著降低，其中當(dāng)外源甜菜堿濃度為0.15 mol/L，外源水楊酸濃度為150 mg/L時(shí)，產(chǎn)生速率達(dá)到最低。

圖6 不同處理對(duì)H2O2含量及O2-產(chǎn)生速率的影響Fig. 6 Effect of different treatments on H2O2 contents and O2 production rate of tobacco leaves under manganese stress

2.7 最佳緩釋劑濃度篩選

采用隸屬函數(shù)分析結(jié)果表明（表2），各指標(biāo)中綜合評(píng)價(jià)值排名第1和第2的是S2和G3，即當(dāng)外源甜菜堿濃度為0.20 mol/L，外源水楊酸濃度為150 mg/L時(shí)緩解效果最好。

表2 不同處理對(duì)錳脅迫緩解的綜合評(píng)價(jià)Tab. 2 Comprehensive evaluation of manganese stress mitigation under different treatments

2.8 各生理指標(biāo)與錳含量的相關(guān)性分析

煙草葉片的錳含量（Mn）可以反映其錳脅迫的程度，對(duì)煙草錳積累量和各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表3）表明，錳含量（Mn）與相對(duì)電導(dǎo)率（REC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及脯氨酸（Pro）含量呈極顯著正相關(guān)，與過氧化氫酶活性（CAT）、可溶性蛋白（SP）及可溶性糖含量（SS）、過氧化氫（H2O2）含量呈顯著正相關(guān)。即在錳脅迫下可通過測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶活性及脯氨酸含量的高低判定外源物質(zhì)緩解煙葉錳脅迫的情況，這3個(gè)指標(biāo)測(cè)定值越高，錳對(duì)煙葉的脅迫越嚴(yán)重。

表3 錳含量與各生理指標(biāo)之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)Tab. 3 Pearson correlation coefficients between Mn content and physiological indexes

3 討論

3.1 外源甜菜堿及水楊酸對(duì)煙葉最大葉長(zhǎng)、葉寬的影響

肖澤華等[3]研究發(fā)現(xiàn)，錳對(duì)黃花草幼苗生長(zhǎng)有高抑低促的作用，且較高濃度的錳脅迫濃度會(huì)顯著降低其生物量的產(chǎn)生。在本試驗(yàn)條件下，根灌3次500 mg/kg的錳會(huì)顯著降低煙草葉片的最大葉長(zhǎng)及葉寬值，這與他們的研究結(jié)果一致。施加甜菜堿及水楊酸后，最大葉長(zhǎng)葉寬的增長(zhǎng)量與CK1相比并不十分顯著，這可能是因?yàn)橥庠次镔|(zhì)的施用與取樣所間隔的時(shí)間較短，所以變化并不明顯。

3.2 外源甜菜堿及水楊酸對(duì)錳含量的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，施加外源水楊酸[20]及甜菜堿[21]可以降低重金屬的毒性。金政等[19]通過研究也發(fā)現(xiàn)隨著錳離子濃度的升高，西南木荷植株的錳含量也會(huì)逐漸升高；Shi等[22]發(fā)現(xiàn)施用外源水楊酸可以降低黃瓜葉片中錳離子的積累，這可能是因?yàn)樗畻钏峥梢哉{(diào)節(jié)離子的跨膜運(yùn)輸[23]，從而抑制了錳離子在植株體內(nèi)的積累。在本試驗(yàn)條件下，本試驗(yàn)研究表明，高錳脅迫使煙草錳含量顯著提高，施加水楊酸及甜菜堿會(huì)顯著降低煙草中的錳含量，這與孟德佳[18]等的研究結(jié)果一致。

3.3 外源甜菜堿及水楊酸對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量的影響

在本研究中，高錳脅迫使煙草葉片中的相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量顯著上升，這與袁滿[24]等的研究一致。前人研究發(fā)現(xiàn)，外源施加甜菜堿及水楊酸可以顯著降低脅迫下植株葉片中相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量[25-27]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，在本試驗(yàn)條件下，隨著外源甜菜堿及水楊酸濃度的升高，相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量先下降后升高，這與錳積累量的變化規(guī)律一致，這說明外源物質(zhì)在較低濃度水平下可緩解錳的脅迫，但是過高的濃度依然有可能會(huì)對(duì)植物造成另一種脅迫。其中，在G3及S2處理相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量均達(dá)到最低，這與隸屬函數(shù)分析的結(jié)果一致。

3.4 外源甜菜堿及水楊酸對(duì)三個(gè)抗氧化酶活性的影響

在本研究中，與CK相比，遭受錳離子脅迫的CK1處理的抗氧化酶活性均顯著提高，這可能是因?yàn)槟婢诚轮参镏谢钚匝鹾繒?huì)上升，從而激活了體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)。但是通過彭喜旭等[28]研究發(fā)現(xiàn)，雖然SOD及POD的活性會(huì)因脅迫而上升，但是不一樣的是過氧化氫酶活性在遭到脅迫后不升反降，它的這種變化可能與植物對(duì)錳脅迫所產(chǎn)生的分子應(yīng)答有關(guān)[29]，所以還有待進(jìn)一步探究。在本試驗(yàn)條件下，通過根灌甜菜堿及水楊酸發(fā)現(xiàn)酶活性受到抑制，這與張曉[12]及李雷[20]等的研究結(jié)果一致，其產(chǎn)生的原因可能是因?yàn)橥庠次镔|(zhì)的施用抑制了ROS的過度積累，所以導(dǎo)致抗氧化酶的活性也受到了抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，SOD及CAT活性在外源甜菜堿濃度為0.20 mol/L、外源水楊酸濃度為150 mg/L時(shí)受抑制的程度最大，說明該濃度的緩解效果最好。

3.5 外源甜菜堿及水楊酸對(duì)可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的影響

前人研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬脅迫下，煙草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量會(huì)升高[30-32]，本研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)。甜菜堿和水楊酸均是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，我們發(fā)現(xiàn)，外源施加這兩種物質(zhì)可以有效降低滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，且總體呈現(xiàn)出在低濃度效果更佳的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樗鼈兊氖┤胧辜?xì)胞滲透勢(shì)下 內(nèi)任何物質(zhì)含量的變化都是由許多不同的代謝共同影響的，所以導(dǎo)致了三種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化規(guī)律并不完全一樣，這與后有麗等[33]的研究結(jié)果一致。其中，可溶性蛋白及脯氨酸含量均在濃度0.15 mol/L甜菜堿及濃度150 mg/L水楊酸處理下達(dá)到最低，這與隸屬函數(shù)分析結(jié)果一致。

3.6 外源甜菜堿及水楊酸對(duì)H2O2含量及O2-產(chǎn)生速率的影響

前人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)積累大量的活性氧[35]，所以當(dāng)煙草受到錳脅迫的時(shí)候，H2O2含量及O2-產(chǎn)生速率顯著提高，這會(huì)對(duì)其造成損傷，但是施加了外源物質(zhì)以后ROS的含量明顯降低，說明對(duì)ROS的產(chǎn)生有一定的抑制作用。在本試驗(yàn)條件下，研究發(fā)現(xiàn)通過對(duì)煙草進(jìn)行錳脅迫會(huì)使其H2O2含量及O2-產(chǎn)生速率顯著提高，但是施加了甜菜堿及水楊酸以后會(huì)略有下降，這與Su等[34]通過利用乙酰膽堿對(duì)煙草鎘脅迫進(jìn)行緩解的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

錳脅迫會(huì)對(duì)煙草產(chǎn)生毒害作用，施加甜菜堿及水楊酸可以明顯緩解高錳傷害。當(dāng)甜外源菜堿濃度為0.20 mol/L、外源水楊酸濃度為150 mg/L時(shí)，錳含量、相對(duì)電導(dǎo)率顯著降低，抗氧化酶活性也得到了抑制，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及過氧化氫含量顯著降低，對(duì)于高錳脅迫有明顯的緩解作用。