覃艷然，王 翠，梁競臻，韋 鈺，王 敏，劉佳佳，謝艷林，蒙文娟，嚴(yán)斯剛，黃小武

（1.柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西柳州 545000；2.融水苗族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西融水 545300）

A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）可引起禽類呼吸器官或全身性感染，早在1901年被分離出。20世紀(jì)70年代，人們開始意識到水禽中所攜帶的AIV是流感病毒的“基因庫”[1]。AIV具有多種亞型，其中H5和H7亞型為高致病性。H5和H7亞型AIV不僅能引起家禽的高發(fā)病率和高死亡率，造成養(yǎng)殖場巨大經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)嚴(yán)重危害人類健康，甚至造成死亡。目前，控制禽流感的最有效途徑是疫苗免疫。

2017年之前，我國只對家禽進(jìn)行H5亞型強(qiáng)制免疫，對H7N9亞型不強(qiáng)制免疫。但2017年2月發(fā)生的H7N9流感大暴發(fā)，不僅危害家禽業(yè)，還感染人，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。為此2017年秋季，H7亞型禽流感也被列為強(qiáng)制免疫病種，使用重組禽流感（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗對家禽進(jìn)行強(qiáng)制免疫。據(jù)中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心報(bào)告，強(qiáng)制免疫能有效降低流感在家禽和人之間的流行[2]。AIV不斷變異，導(dǎo)致我國流行的AIV保持了多血清型、多基因型、多致病性并存的特點(diǎn)[3]。因此，在多個(gè)抗原性毒株共同流行的情況下，需要多價(jià)禽流感滅活疫苗。2019年下半年，我國用重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 Re-2株）替換了重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 Re-1株）。到目前為止，未見關(guān)于三價(jià)滅活疫苗田間試驗(yàn)?zāi)冈纯贵w消長規(guī)律的相關(guān)報(bào)道。由于雛鴨體內(nèi)母源抗體對疫苗免疫效果有一定的影響，因此本試驗(yàn)對雛鴨禽流感母源抗體的變化規(guī)律進(jìn)行監(jiān)測，旨在了解雛鴨體內(nèi)母源抗體消長規(guī)律，以期為制定重組禽流感病毒（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗的最佳首次免疫時(shí)間提供依據(jù)。

1 材料

1.1 診斷試劑

H5亞型AIV（Re-11株和Re-12株）血凝抑制試驗(yàn)抗原，由哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司提供；H7亞型AIV（Re-2株）血凝抑制試驗(yàn)抗原以及H5亞型AIV（Re-11株、Re-12株）、H7亞型AIV（Re-2株）標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清，由哈爾濱國生生物科技股份有限公司提供；H5亞型AIV（rSD57株、rFJ56株）血凝抑制試驗(yàn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清，均由華南農(nóng)大生物藥品有限公司提供；H5亞型與H7亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒，由哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司提供。

1.2 主要儀器

微量移液器、V型反應(yīng)板、微型平板振蕩器、熒光PCR儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和疫苗

本試驗(yàn)所用的動(dòng)物均由養(yǎng)殖場提供，所用的兩種重組禽流感病毒（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗分別由哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司和華南農(nóng)大生物藥品有限公司提供。這兩種苗均可用于預(yù)防由H5亞型2.3.2.1d分支、2.3.4.4d分支和H7亞型AIV引起的禽流感。

2 方法

2.1 試驗(yàn)分組

免疫哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司的重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活苗（H5N1 Re-11+Re-12株、H7N9 H7-Re-2株、H5N2）的種鴨為A組，免疫華南農(nóng)大生物藥品有限公司的重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N2 rSD57株+rFJ56株、H7N9 rGD76株）的種鴨為B組。對兩組種鴨分別在10、55、110日齡注射對應(yīng)的重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗，370日齡時(shí)采集種鴨血清檢測抗體，選擇抗體水平高的種鴨蛋進(jìn)行孵化；從A組和B組種鴨蛋剛孵化出的臨床健康雛鴨中各選300羽，不注射任何疫苗，在同一飼養(yǎng)場一直飼養(yǎng)到28日齡。

2.2 雛鴨血清樣品采集和抗體檢測

2.2.1血清樣品采集 在雛鴨1、7、14、21和28日齡時(shí)，用腳靜脈或翅靜脈采血的方法，分別從300羽雛鴨中隨機(jī)抽取100羽雛鴨采血，并分離出血清，-20 ℃保存待檢。

2.2.2抗體測定 制備1%的雞紅細(xì)胞懸液，通過血凝（HA）試驗(yàn)測定H5亞型Re-11株、Re-12株、rSD57株、rFJ56株和H7亞型（Re-2株、rGD76株）HA抗原效價(jià)，根據(jù)抗原效價(jià)配置血凝抑制（HI）試驗(yàn)需要的四單位病毒，運(yùn)用四單位病毒通過HI試驗(yàn)檢測雛鴨血清中AIV抗體滴度。具體操作方法參考《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2003）。

2.2.3結(jié)果判定 標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對照孔滴度≤2log2，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對照孔誤差不超過1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果成立；樣品血清HI效價(jià)≥4log2，判為陽性；HI效價(jià)＜4log2，判為陰性。

2.3 雛鴨棉拭子樣品采集及檢測

2.3.1棉拭子采集 用棉簽采集100羽1日齡雛鴨喉頭與泄殖腔分泌物，然后將棉簽放入有保存液的EP管中，-20 ℃保存待檢。

2.3.2病原檢測 用H5與H7亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行樣品RNA提取，配制實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系，通過熒光PCR儀的循環(huán)反應(yīng)，擴(kuò)增特異片段。詳細(xì)操作參照試劑盒使用說明書。

2.3.3結(jié)果判定 陽性對照Ct ≤30并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對照無Ct值并且無特異性擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品Ct ≤30并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為陽性；被檢樣品Ct ≥36，判為陰性；被檢樣品30 ＜Ct ＜36并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，需重新抽樣提取RNA，擴(kuò)增后再進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判為陽性。

3 結(jié)果與分析

3.1 種鴨抗體檢測

種鴨在370日齡時(shí)AIV血清抗體達(dá)到較高水平，各亞型抗體陽性率均在98.89%以上。具體抗體檢測結(jié)果見表1。

表1 種鴨AIV抗體檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.2 A組雛鴨母源抗體檢測

A組雛鴨母源抗體在1、7、14、21和28日齡時(shí)的檢測結(jié)果見表2。各亞型母源抗體在1日齡時(shí)平均滴度均達(dá)最高水平，且離散程度低；隨著日齡增長，各亞型母源抗體水平逐漸下降。盡管7日齡時(shí)母源抗體陽性率仍在70%以上，但平均抗體水平已下降到（4.56～4.26）log2。

表2 A組雛鴨AIV母源抗體檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.3 B組雛鴨母源抗體檢測

B組雛鴨AIV母源抗體在1、7、14、21和28日齡時(shí)檢測結(jié)果見表3。各亞型母源抗體在1日齡時(shí)平均滴度均達(dá)最高水平，且離散程度低；隨著日齡增長，各亞型母源抗體水平逐漸下降；7日齡時(shí)母源抗體對雛鴨還有一定的保護(hù)作用，而14日齡時(shí)母源抗體陽性率下降至45%～79%，平均抗體水平下降到（3.06～4.23）log2。

表3 B組雛鴨AIV母源抗體檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.4 雛鴨病原檢測

在1日齡雛鴨的喉頭/泄殖腔棉拭子中，未檢測出H5亞型與H7亞型AIV（圖1）。

圖1 H5與H7亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線

4 討論

禽流感目前仍是世界養(yǎng)禽業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)。近年來，H5亞型AIV出現(xiàn)了clade2.2、clade2.3.4、clade2.3.2.1、clade2.3.4.4等分支或亞分支。目前流行的H5亞型AIV主要為clade2.3.4.4和clade2.3.2.1分支毒株，其中優(yōu)勢流行毒株為clade2.3.4.4[3-4]。而2019年投入使用的疫苗（Re-11+Re-12株、rSD57株+rFJ56株）與當(dāng)前流行毒株抗原特性相匹配，對預(yù)防H5亞型禽流感發(fā)揮了重要作用。對于H7N9亞型來說，H7N9流感疫情在我國已經(jīng)暴發(fā)多次，引起每次暴發(fā)的AIV基因都發(fā)生了重組。2017年下半年實(shí)施強(qiáng)制免疫后，我國H7N9流感得到了較好的控制，所以對家禽進(jìn)行免疫接種是預(yù)防禽流感暴發(fā)的重要途徑。但也發(fā)現(xiàn)接種疫苗后一些家禽仍可感染發(fā)病，其中母源抗體是影響疫苗免疫效果的重要因素之一[5]。在母源抗體較高時(shí)接種疫苗，會(huì)中和一部分抗原，從而不能產(chǎn)生較好的免疫效果；但接種過晚，會(huì)使母源抗體過低或出現(xiàn)抗體空白期，會(huì)對家禽健康造成一定威脅。因此，掌握AIV母源抗體消長規(guī)律，對家禽科學(xué)免疫程序制定具有重要意義。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高抗體水平種鴨孵出的雛鴨，1日齡時(shí)其母源抗體水平也較高，平均抗體滴度可達(dá)7.27log2以上，從其喉頭/泄殖腔棉拭子中也未檢出AIV。這說明1日齡雛鴨的抗體為母源抗體，而非感染抗體。因此，在產(chǎn)蛋前有必要對種鴨進(jìn)行加強(qiáng)免疫，這為出生雛鴨提供強(qiáng)高效保護(hù)力起重要作用。

本試驗(yàn)通過對A、B兩組雛鴨進(jìn)行不同日齡AIV母源抗體檢測，發(fā)現(xiàn)隨著日齡增長各亞型母源抗體水平逐漸下降，保護(hù)時(shí)間在14日齡以內(nèi)或者更短。這可能與種鴨的免疫程序[6]、疫苗本身所含抗原及飼養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān)。在1日齡時(shí)，A、B兩組雛鴨各亞型母源抗體平均滴度分別在7.27log2、7.71log2以上，群體抗體陽性率分別為100%、88%～100%，此時(shí)的母源抗體對雛鴨具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。在7日齡時(shí)，A、B組雛鴨各亞型母源抗體平均滴度分別降至（4.56～4.26）log2、（4.93～6.27）log2，且群體抗體陽性率分別降至76%～85%、88%～96%，此時(shí)的母源抗體對雛鴨仍有保護(hù)作用。而在14日齡時(shí)，兩組雛鴨母源抗體水平迅速下降，其中：A組群體抗體陽性率下降到21%～25%，且各亞型平均滴度都下降到2.55log2以下，由此得出A組的群體高效保護(hù)力在7日齡以內(nèi)；B組雛鴨群體抗體陽性率下降至45%～79%，且各亞型母源抗體平均滴度都下降到（3.06～4.23）log2，說明B組的群體高效保護(hù)力在14日齡以內(nèi)。到21日齡時(shí)，A組雛鴨群體抗體的陽性率已經(jīng)下降到1%以下，且各亞型母源抗體平均滴度都下降到0.43log2以下，B組群體抗體陽性率下降到13%以下，且各亞型母源抗體平均滴度都下降到1.37log2以下，此時(shí)母源抗體已不足以保護(hù)鴨群抵御感染風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)28日齡時(shí)，兩組雛鴨群體抗體陽性率均以下降到0，且各亞型母源抗體平均滴度也都下降到0，已經(jīng)是母源抗體空白期。由于首免時(shí)疫苗會(huì)與母源抗體發(fā)生中和反應(yīng)，降低疫苗免疫效果，因此在母源抗體水平較高時(shí)，不應(yīng)進(jìn)行疫苗免疫；而當(dāng)母源抗體降到最低時(shí)才進(jìn)行免疫，會(huì)出現(xiàn)免疫空白期，從而增加群體感染風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，2種重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗最佳首免時(shí)間為7～14日齡。

5 結(jié)論

高抗體水平種鴨能夠使后代雛鴨具有較高水平的AIV母源抗體，但雛鴨母源抗體保護(hù)時(shí)間較短；重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活苗（H5N2 rSD57株+rFJ56株、H7N9 rGD76株）對雛鴨的保護(hù)期長于重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活苗（H5N1 Re-11+Re-12株、H7N9 H7 Re-2、H5N2）；兩 種重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活苗最佳首免時(shí)間為7～14日齡。