施茂林，柏玉娣，王 超，李思琪，周代君，彭晶晶，孫非凡，李 東，張 濤

1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腫瘤診治中心，四川 成都 610083；3.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院病理科，四川 成都 610083；4.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都611756

腫瘤細胞PD-L1表達水平是程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）抑制劑主要的療效預(yù)測生物標(biāo)志物之一［1-4］，最近的研究表明，PD-L1高表達的肺癌患者生存期更短［5］。同時，對于表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變型患者，PD-L1表達水平可以影響表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFRTKI）靶向治療的效果［6-7］。

本研究重點回顧性分析了中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腫瘤診治中心收治的一線接受培美曲塞為基礎(chǔ)化療的晚期肺腺癌患者癌組織中PD-L1表達對培美曲塞為基礎(chǔ)的化療效果的影響，并探討其潛在機制。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者年齡≥18歲且＜85歲；② 預(yù)期壽命≥半年；③組織病理學(xué)活檢確診為肺腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理學(xué)診斷為非腺癌或含腺癌成分的混合型癌；② 同時合并其他腫瘤；③合并急性致死性疾病；④ 合并其他嚴(yán)重疾病，如肝硬化失代償期、尿毒癥、嚴(yán)重致死性心臟疾病等；⑤ 病歷資料不完全；⑥ 組織標(biāo)本不足以完善免疫組織化學(xué)檢測。本研究收集了2015年10月—2018年12月中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腫瘤診治中心確診為肺腺癌且符合研究入組條件的患者共185例，其中51例晚期肺腺癌患者一線接受培美曲塞聯(lián)合鉑類藥物的治療（至少接受2個周期）?；熐熬邮苋~酸、維生素B12及地塞米松預(yù)處理。培美曲塞：500 mg/m2，第1天；順鉑：75 mg/m2，第1天；卡鉑：AUG=5～6，第1天；約21 d重復(fù)。所有患者治療過程中均未接受免疫治療。本研究通過了西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（批件號2020ky009）。

采用實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST）1.1評價療效，包括完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進展（progressive disease，PD）。

同時以6種肺腺癌細胞系為研究對象，檢測各細胞系中PD-L1、胸苷酸合酶（thymidylate synthase，TS）的蛋白水平和mRNA表達。

1.2 隨訪

采用住院、門診、電話隨訪，每3個月隨訪1次，末次隨訪時間為2020年5月1日。截至末次隨訪，全組中位隨訪18.1個月。PFS定義為從接受化療開始，到出現(xiàn)疾病進展或出現(xiàn)任何原因的死亡或末次隨訪。OS定義為從確診到任何原因?qū)е碌乃劳龌蚰┐坞S訪。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1437、H1395、H1944、HCC827均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，H3255購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。肺腺癌細胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清（以色列BI公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（以色列BI公司）中，于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞提取蛋白或總RNA。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測

采用SP染色法檢測185例肺腺癌患者癌組織中PD-L1和TS的表達水平。癌組織石蠟包埋標(biāo)本做4 μm連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、熱抗原修復(fù)、淬滅內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉，溫育PD-L1兔抗人單克隆抗體（22C3，美國Agilent公司）或TS鼠抗人單克隆抗體（TS106，美國Invitrogen公司）4 ℃過夜，37 ℃溫育生物素標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG二抗、37 ℃溫育辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、鹽酸乙醇分化、中性樹膠封片。每次實驗操作中均設(shè)置陽性對照組（PD-L1陽性對照：胎盤組織；TS陽性對照：TS表達陽性腸癌組織）和陰性對照組（PBS替代一抗）。

PD-L1結(jié)果判讀：細胞膜顯棕黃色的腫瘤細胞判定為PD-L1陽性細胞。PD-L1陽性細胞比例評分［8-9］（tumor proportion score，TPS）：判讀在200倍鏡下至少觀察100個腫瘤細胞中PD-L1陽性腫瘤細胞占比。以TPS＜1%定義為陰性，TPS≥1%定性為陽性。TS結(jié)果判讀：細胞質(zhì)或細胞核顯棕黃色的腫瘤細胞判定為TS陽性細胞。以TPS＜10%定義為陰性，TPS≥10%定性為陽 性［10］。所有染色結(jié)果均由病理科醫(yī)師雙盲 判讀。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

取對數(shù)生長期細胞用細胞裂解液充分裂解細胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取20 μL蛋白樣品，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。5%BSA于37 ℃封閉2 h，TBST漂洗，4 ℃過夜溫育PD-L1抗體（E1L3N，美國CST公司）或TS抗體（TS106，美國Invitrogen公司），TBST液漂洗，37 ℃溫育二抗1 h。用洗膜緩沖液（Tris-buffered saline Tween，TBST）充分洗膜后顯影。Image J行灰度值分析。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

取對數(shù)生長期細胞用TRIzol試劑提取總RNA，按PrimeScriptTMRT Master Mix［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。10 μL RTFQ-PCR反應(yīng)體系含 2.5 μL cDNA產(chǎn)物、0.3 μL引物、0.15 μL探針、2.05 μL DEPC水和5 μL FastStart Universal Probe Master（瑞士Roche公司）。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循環(huán)42個周期。以2-△△CT方法算出目的mRNA的相對表達量。引物及探針號（瑞士Roche公司）：CD274（PD-L1）探針號為#25，有義鏈為5’-GGCATCCAAGATACAAACTCAA-3’，反義鏈為5’-CAGAAGTTCCAATGCTGGATTA-3’；TYMS（TS）探針號為#2 5，有義鏈為5’-CCCAGTTTATGGCTTCCAGT-3’，反義鏈為5’-GCAGTTGGTCAACTCCCTGT-3’；GADPH探針號為#25，有義鏈為5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’，反義鏈為5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用，計數(shù)資料采用例數(shù)（率）；計量資料相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗，計數(shù)資料相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)性檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，影響預(yù)后因素的單因素分析采用log-rank檢驗，多因素分析采用COX回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 51例晚期肺腺癌患者癌組織PD-L1表達對培美曲塞為基礎(chǔ)的化療療效的影響

51例晚期肺腺癌患者一線接受培美曲塞聯(lián)合鉑類的治療，其基線特征見表1。在一線治療中，接受培美曲塞聯(lián)合順鉑治療的患者 38例（74.5%），接受培美曲塞聯(lián)合卡鉑治療的患者13例（25.5%），無培美曲塞單藥治療病例。在維持治療階段，12例（23.5%）患者接受培美曲塞單藥的維持治療。

表1 51例晚期肺腺癌患者的臨床病理學(xué)基線特征Tab.1 Clinicopathological baseline characteristics of 51 patients with advanced lung adenocarcinoma

PD-L1主要表達于腫瘤細胞膜（圖1）。在51例患者中，20例（39.2%）患者PD-L1表達陽性，31例（60.8%）患者PD-L1表達陰性。PD-L1表達陽性患者接受培美曲塞為基礎(chǔ)化療的客觀有效率（objective response rate，ORR）和疾病控制率（disease control rate，DCR）與PD-L1表達陰性患者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ORR：20.0%vs35.5%，χ2=1.404，P=0.236；DCR：60.0%vs80.6%，χ2=2.602，P=0.1 0 7；表2）。PD-L1表達陰性患者的PFS顯著優(yōu)于PD-L1表達陽性患者（mPFS：5.6 個月vs4.1個月，log-rank=5.406，P=0.020；圖2A）。兩組患者的OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（mOS：15.9個月vs12.7個月，log-rank=0.525；P=0.469，圖2B）。上述結(jié)果表明，PD-L1表達陰性患者相對PD-L1表達陽性患者可以從培美曲塞為基礎(chǔ)的化療中取得更多PFS生存獲益，PD-L1表達可能影響晚期肺腺癌患者培美曲塞為基礎(chǔ)的一線化療的效果。

圖1 肺腺癌患者癌組織中PD-L1免疫組織化學(xué)染色情況Fig.1 Immunohistochemical staining of PD-L1 in cancer tissues of patients with lung adenocarcinoma

表2 51例晚期肺腺癌患者的治療評價Tab.2 Responses of 51 patients with advanced lung adenocarcinoma assessed by RECIST version 1.1

圖2 PD-L1表達對51例晚期肺腺癌患者培美曲塞為基礎(chǔ)化療療效和OS的影響Fig.2 Effect of PD-L1 expression on the efficacy of pemetrexed-based chemotherapy and OS in 51 patients with advanced lung adenocarcinoma

2.2 51例晚期肺腺癌患者癌組織TS表達對培美曲塞為基礎(chǔ)的化療效果的影響

TS表達于細胞質(zhì)或細胞核（圖3）。在51例患者中，24（47.1%）例患者TS表達陽性，27（52.9%）例患者TS表達陰性。TS表達陽性患者的DCR顯著劣于TS表達陰性患者（DCR：54.2%vs88.9%，χ2=7.692，P=0.006），而兩組患者的ORR差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ORR：16.7%vs40.7%,χ2=3.547，P=0.060）。TS表達陰性患者的PFS顯著優(yōu)于TS表達性組（mPFS：6.9個月vs4.1個月，log-rank=9.471，P=0.002；圖4A，表2）。兩組患者的OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（mOS：15.9個月vs12.4個月，log-rank=0.647，P=0.421；圖4B）。

圖3 肺腺癌患者癌組織中TS免疫組織化學(xué)染色情況Fig.3 Immunohistochemical staining of TS in cancer tissues of patients with lung adenocarcinoma

圖4 TS表達對51例晚期肺腺癌患者培美曲塞為基礎(chǔ)化療療效和OS的影響Fig.4 Effect of TS expression on the efficacy of pemetrexed-based chemotherapy and OS in 51 patients with advanced lung adenocarcinoma

2.3 影響51例晚期肺腺癌患者PFS的單因素和多因素分析

單因素分析發(fā)現(xiàn)：PD-L1和TS表達陽性是影響晚期肺腺癌患者PFS的危險因素［PD-L1陰性vs陽性：HR=2.002（1.100～3.645），P=0.023；TS陰性vs陽性：HR=2.205（1.367～4.587），P=0.003；表3］。多因素分析發(fā)現(xiàn)：TS表達陽性是影響晚期肺腺癌患者PFS的獨立危險因素［TS陰性vs陽性：HR=3.245（1.091～9.652），P=0.034；表3］。

表3 影響51例晚期肺腺癌患者PFS的單因素、多因素分析Tab.3 The effect of clinicopathological characteristics,PD-L1 and TS expression on PFS of 51 advanced lung adenocarcinoma patients

2.4 肺腺癌組織和肺癌細胞系中PD-L1與TS表達的相關(guān)性分析

本研究結(jié)果顯示，在51例一線接受培美曲塞為基礎(chǔ)化療的晚期肺腺癌患者中，癌組織PD-L1表達與TS表達顯著相關(guān)（rs=0.691，P＜0.001；表4）。進一步把研究對象拓展到185例肺腺癌患者，其中包括了不同腫瘤分期和接受多種不同的一線治療模式的肺腺癌患者，其基線特征見表5，Spearman秩相關(guān)性檢驗結(jié)果同樣提示肺腺癌組織中PD-L1表達與TS表達顯著相關(guān)（rs=0.588，P＜0.001）。

表4 51例晚期肺腺癌患者肺癌組織PD-L1與TS表達的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation between PD-L1 and TS expression in 51 patients with advanced lung adenocarcinoma

表5 185例肺腺癌患者的臨床病理基線特征Tab.5 Clinicopathological baseline characteristics of 185 patients with lung adenocarcinoma

Western blot和RTFQ-PCR檢測結(jié)果提示，在6種肺腺癌細胞系中，PD-L1與TS無論在蛋白表達水平還是mRNA表達水平均呈顯著正相關(guān)性（蛋白水平：rs=0.899，P=0.015；mRNA表達：rs=0.861，P=0.028；圖5、圖6、表6）。

圖5 肺腺癌細胞系中PD-L1和TS蛋白水平的表達及其相關(guān)性Fig.5 Protein expressions and correlation of PD-L1 and TS in lung adenocarcinoma cell lines

圖6 肺腺癌細胞系中PD-L1和TS mRNA水平的表達及其相關(guān)性Fig.6 RNA expressions and correlation of PD-L1 and TS in lung adenocarcinoma cell lines

表6 185例肺腺癌患者肺癌組織PD-L1與TS表達的相關(guān)性分析Tab.6 Correlation between PD-L1 and TS expressions in 185 patients with lung adenocarcinoma

3 討 論

抗腫瘤治療的療效預(yù)測相關(guān)生物標(biāo)志物研究是目前腫瘤學(xué)臨床和科研領(lǐng)域的焦點和前沿。在免疫治療領(lǐng)域，PD-L1作為目前PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑治療效果預(yù)測的伴隨或補充診斷標(biāo)志物已在肺癌臨床診療實踐中廣泛應(yīng)用［1-4］。近年來，PD-L1表達對于EGFR敏感突變型肺癌患者EGFR-TKI靶向治療效果的影響也逐漸引起諸多學(xué)者的關(guān)注。多項研究［6-7］發(fā)現(xiàn)：EGFR-TKI原發(fā)耐藥的EGFR敏感突變型肺腺癌患者相對于非原發(fā)耐藥的患者具有更高的PD-L1表達水平，癌組織PD-L1高表達的患者相對于PD-L1低表達或表達陰性的患者接受EGFR-TKI治療的ORR更低、PFS更短，而EGFR-TKI原發(fā)耐藥患者相對于獲得性耐藥患者具有更高的PD-L1陽性率，表明PD-L1表達水平不僅能夠預(yù)測PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑的療效，同時也可以影響EGFR敏感突變型患者EGFR-TKI靶向治療的療效。然而，這些研究雖然觀察到了PD-L1表達水平能夠影響EGFR敏感突變型肺癌患者EGFR-TKI靶向治療的療效這一現(xiàn)象，但并沒有對其潛在生物學(xué)機制進行進一步的分析和解釋。

培美曲塞是目前驅(qū)動基因陰性非鱗非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的一線化學(xué)藥物。前期多項前瞻性臨床研 究［10-12］表明TS表達水平是預(yù)測NSCLC患者培美曲塞化療效果最重要的生物標(biāo)志分子，TS高表達的患者相對于TS低表達或陰性患者接受培美曲塞為基礎(chǔ)化療的療效更差。近年來，培美曲塞為基礎(chǔ)的化療聯(lián)合PD-1單抗聯(lián)合治療的優(yōu)勢已經(jīng)得到多項大型前瞻性Ⅲ期隨機對照研究［8-9］的證實，而PD-L1的表達水平能否影響培美曲塞為基礎(chǔ)的化療效果引起研究者的關(guān)注。Zhang 等［13］首先報道了晚期肺腺癌患者中PD-L1表達對培美曲塞為基礎(chǔ)的化療效果的影響，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達陽性的患者相對于PD-L1陰性的患者接受培美曲塞為基礎(chǔ)的化療后具有更長的PFS。而我們的研究結(jié)果卻與之恰恰相反。進一步分析兩項研究結(jié)論存在差異的可能原因，我們注意到兩項研究肺癌組織PD-L1免疫組織化學(xué)檢測所采用的PD-L1抗體和陽性判斷閾值不同。Zhang等［13］的研究主要采用SP142抗體（Ventana/Roche）及檢測平臺，以TPS≥5%為PD-L1表達陽性閾值；我們研究采用22C3抗體（Dako/Agilent）及檢測平臺，以TPS≥1%為PD-L1表達陽性的閾值。不同PD-L1檢測抗體和陽性閾值設(shè)定可能會對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定影響。最近的一項關(guān)于不同PD-L1檢測抗體檢測分析效能的臨床研究藍印計劃（BluePrint）［14-15］研究結(jié)果顯示，22C3抗體可能較SP142抗體具有更好的檢測效能和檢測結(jié)果一致性。其次，兩項研究都對肺腺癌患者肺癌組織中培美曲塞療效主要預(yù)測標(biāo)志分子TS進行了檢測和療效分析，但結(jié)果并不一致。我們的研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織TS高表達患者相對于TS低表達患者培美曲塞化療效果較差，DCR更低、PFS更短，這與前期文獻報道結(jié)果相一 致［10-12］。最后，我們的研究不僅觀察到PD-L1陽性表達影響培美曲塞為基礎(chǔ)化療效果，而且進一步探索和分析了其潛在的分子機制，并提出了可能的生物學(xué)解釋。然而，由于兩項研究都是單中心回顧性研究分析，都受制于樣本量等客觀因素的影響，研究證據(jù)級別均存在一定局限性。隨后我們也將繼續(xù)開展前瞻性臨床研究，擴大研究樣本量，進一步細化不同PD-L1表達水平（如PDL1≥1%、25%、50%）對于晚期肺腺癌患者培美曲塞化療效果的影響，明確二者之間是否存在一定的量效關(guān)系。