邵 晨，閆冬梅，王艷娟，趙亞麗，楊舒婷，王志偉，劉 雙，仝 嬌，王雷雷

神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病(neurodevelopmental disabilities，NDDs)通常是指由于異常的神經(jīng)發(fā)育基礎(chǔ)而導(dǎo)致的精神、心理、行為發(fā)育障礙，包括發(fā)育落后/智力障礙(developmental delay/intellectual disability,DD/ID)、學(xué)習(xí)障礙、自閉癥癥候群(autism spectrum disorders,ASD)等，影響超過15%的兒童[1]。DD/ID是指發(fā)育成熟以前(18歲以前)出現(xiàn)的認(rèn)知和適應(yīng)行為障礙，是兒科門診較為常見的疾病之一，國外報(bào)道DD/ID的患病率為1%～3%[2]，ASD是一組嚴(yán)重影響兒童健康、具有顯著臨床和病因異質(zhì)性的常見的NDDs。

NDDs發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與環(huán)境、遺傳等因素關(guān)系密切[3]，其中遺傳因素是主要因素之一。以ASD為例，一半以上的致病危險(xiǎn)因素可歸因于遺傳學(xué)的變異；DD/ID的患兒中，有一半以上可以找到遺傳學(xué)病因[4]。遺傳性因素包括染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常、單基因病、線粒體病、多基因和/或表觀遺傳異常等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常占整個(gè)遺傳因素的25%～30%[5]?？截悢?shù)變異(copy number variations，CNVs)是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的，一般指長度為1 kb至數(shù)Mb的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復(fù)。CNVs是導(dǎo)致DD/ID和ASD發(fā)生的重要病因，可以引起基因組與分子表型的異質(zhì)性，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

近年來，隨著基因組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，NDDs遺傳分子機(jī)制及診斷方法的研究取得了很大的進(jìn)展[6]。染色體微陣列芯片分析(chromosomal microarray analysis,CMA)又稱染色體基因芯片分析技術(shù)，能夠檢測出>100 kb的CNVs[7]，在西方國家DD/ID、ASD等疾病的臨床診斷中得到廣泛應(yīng)用[8-9]。相比于傳統(tǒng)的染色體核型分析，CMA能夠顯著提高具有臨床意義的CNVs的檢出率，已成為DD/ID、ASD及多發(fā)畸形等疾病的一線實(shí)驗(yàn)診斷方法[10-11]。文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道顯示，CMA在“原發(fā)性”智力障礙或者無法解釋的發(fā)育遲緩、自閉癥和先天性結(jié)構(gòu)畸形病例中體現(xiàn)出了重大應(yīng)用價(jià)值。但CMA技術(shù)應(yīng)用于我國NDDs兒童診斷的臨床實(shí)踐起步較晚，目前我國CMA在NDDs兒童的臨床分子診斷中的檢測性能等信息不夠完善，因此本研究對100例NDDs患兒進(jìn)行CMA檢測，針對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，該研究將有助于擴(kuò)充臨床數(shù)據(jù)，為CMA在兒科疾病診斷中的廣泛應(yīng)用和遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年3月至2018年8月于連云港市婦幼保健院就診的NDDs患兒100例，其中男72例，女28例，年齡40 d至11歲，平均年齡3.31歲；ASD患兒55例，DD/ID患兒45例。所有患兒的父母均進(jìn)行CMA檢測前的遺傳咨詢并簽署知情同意書，本研究經(jīng)連云港市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)年齡0～18歲；(2)ID：依據(jù)韋氏智力測試(WISC-R及WPPST)IQ<70；DD：嬰幼兒采用Gesell發(fā)育量表評測，DQ<75者診斷發(fā)育遲緩；ASD患兒為通過美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(第5版)[14]；(3)臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查無代謝性病、單基因遺傳變性病證據(jù)；(4)獲得病人父母或其他監(jiān)護(hù)人的知情同意，愿意參加本研究。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)診斷不明確，或伴有其他神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性疾病；(2)細(xì)胞遺傳學(xué)分析已明確病因的患兒，如21-三體、18-三體、13-三體綜合征等；(3)臨床資料不齊全和/或已診斷病因的患兒病例；(4)患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患兒，如腦癱、癲癇、精神分裂癥、Rett綜合征等精神神經(jīng)疾病及聾啞等。

1.4 研究方法

1.4.1 CMA檢測 樣本采集：利用EDTA抗凝采血管采集本研究中NDDs患兒外周血2 mL。采用提取試劑盒(QIAamp@DNA Blood Mini Kit)提取全基因組DNA，并于-20 ℃環(huán)境中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。染色體微陣列分析檢測將5 μL全基因組DNA用NspI酶隨機(jī)消化為短片段，消化后產(chǎn)物末端補(bǔ)齊，連接上共同引物。將上述處理后樣本DNA擴(kuò)增為150～2 000 bp的片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過磁珠法純化。將純化產(chǎn)物通過片段化酶片段化為25～125 bp的片段，連接上生物素標(biāo)記。將標(biāo)記后產(chǎn)物與雜交液混合均勻并變性后加載于美國Affymetrix公司的CytoScan750K芯片(包括550 000個(gè)非多態(tài)性CNV探針和200 000個(gè)SNP探針)，置于雜交儀中(Genechip hybridization oven 645)50 ℃，60 r/min，雜交16～18 h后，置于洗滌工作站(GeneChip@FluidiesStation450Dx v.2)洗滌并染色。將洗滌后芯片置于掃描儀(GeneChip@Scanner 3000Dx v．2withAutoLoader)中掃描，獲取數(shù)據(jù)并加載于配套ChASv3.0軟件后利用相關(guān)的生物信息學(xué)方法分析檢測結(jié)果。

1.4.2 CMA數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判讀 選擇芯片識別的≥200 kb的微缺失和≥500 kb的微重復(fù)且可信度≥90%的片段利用各種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。相關(guān)數(shù)據(jù)庫主要包括人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance In Man，OMIM，https://www.omim.org/)、國際公共良性CNVs數(shù)據(jù)庫(Database of Genomic Variants，DGVs，http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、人類基因組變異和表型數(shù)據(jù)庫(Database of genomic variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resources，DECIPHER，http://decipher.Sanger.Ac.uk/)，人類遺傳學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)微陣列委員會(huì)在線數(shù)據(jù)庫(International Standard Cytogenomic Array Consortium，ISCA，http://www.iscaconsortium.org/)、美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/)等。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)對CNVs解釋的標(biāo)準(zhǔn)和指南[10]，按照臨床意義將所有檢測到的非多態(tài)性CNVs分成以下5類：(1)致病性CNVs；(2)可能為致病性CNVs；(3)臨床意義未知CNVs；(4)可能良性CNVs；(5)良性CNVs。

2 結(jié)果

2.1 CMA檢測出的CNVs 利用750K芯片對100例DD/ID及ASD患兒進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示22例(22.00%，22/100)患兒檢測到染色體拷貝數(shù)變異，攜帶病理性及可能致病CNVs患兒14例(14/100,14.00%)，共涉及17個(gè)致病性及可能致病性CNVs，包括14個(gè)微缺失(1q21.1q21.2、6p22.3、7q11.23、7q11.23、7q31.1、8p23.3p23.1、9q34.3、10q26.13q26.3、15q11.2q13.2、15q11.2q13.1、15q11.2q13.1、Xp22.32p22.31、Xp22.33p11.23、Xq21.1q28)；3個(gè)微重復(fù)(2q36.3q37.3、9q34.12q34.3、8q24.23q24.3)(見表1)，檢出率達(dá)14.00%。攜帶臨床意義未知CNVs的患兒有8例(8/100,8.00%)。78例患兒染色體未見明顯異常，所有樣本的檢測成功率為100%。

表1 CMA檢測結(jié)果[n;百分率(%)]

對45例DD/ID患兒進(jìn)行CMA檢測發(fā)現(xiàn)12例病理性或可能致病性CNVs，檢出率為26.67%，其中男3例，女9例。12例DD/ID患兒中檢測出的14個(gè)病理性及可能致病性CNVs，其中12個(gè)染色體微缺失，2個(gè)染色體微重復(fù)(見表2)。同時(shí)在對55例ASD患兒CMA檢測中發(fā)現(xiàn)2例病理性及可能致病性CNVs，檢出率為3.64%，其中男1例，女1例。在2例ASD患兒中檢測出的3個(gè)病理性CNVs包含2個(gè)染色體微缺失，1個(gè)微重復(fù)(見表3)；病理性及可能致病性CNVs中發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的OMIM基因有MCPH1、CLN8、TRAPPC9、GPAA1、PUF60等。

表2 DD/ID病人中CMA檢測結(jié)果為病理性及可能致病CNVs

表3 ASD病人中CMA檢測結(jié)果為病理性及可能致病CNVs

對8例臨床意義未知病例進(jìn)行CMA檢測發(fā)現(xiàn)10個(gè)臨床意義未知CNVs，包括4個(gè)微缺失(3p22.2、5q33.3、7q34、22q13.2)，6個(gè)微重復(fù)(2q21.3q22.1、16q24.3、19q13.42q13.43、Xq11.2q12、Xq26.2、Yq11.223q11.23)(見表4)。在這些患兒中發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的OMIM基因，分別是BRAF、ANKRD11，F(xiàn)ANCA、AMER1、GPC3。

表4 臨床意義未知CNVs

2.2 CNVs染色體分布 檢測出2例ASD患兒的病理性CNVs,分別分布在8號、X染色體上，其中1例患兒在8號染色體上同時(shí)發(fā)現(xiàn)缺失片段及重復(fù)片段。12例DD/ID患兒檢測出的病理性及可能致病性CNVs分布在1號、2號、6號、7號、9號、10號、15號、X號染色體上。其中3例患兒病理性及可能致病性CNVs分布在15號染色體上，3例患兒病理性及可能致病性CNVs分布在7號染色體上。2例患兒病理性及可能致病性CNVs分布在9號染色體上，2例患兒病理性及可能致病性CNVs分布在X染色體上。1例患兒X染色體上發(fā)現(xiàn)2個(gè)缺失片段。在8例患兒檢測出的臨床意義未知的CNVs分布在2號、3號、5號、7號、16號、19號、22號、X、Y染色體上。其中1例患兒分別在3號、5號、7號染色體上發(fā)現(xiàn)缺失片段。2例患兒臨床意義未知CNVs分布在X染色體(見圖1)。

1例診斷為DD的患兒，CMA技術(shù)檢測的致病性CNVs分析圖見圖2，該片段有兩處缺失，分別是：arr[hg19]Xp22.33p11.23(168,551 -46,489,686)x1，大小為46.3 Mb，包含OMIM基因數(shù)156個(gè)；arr[hg19]Xq21.1q28 (82,441,085-155,233,098)×1，大小為72.79Mb，包含OMIM基因數(shù)304個(gè)，患兒為女孩，7個(gè)月大，表現(xiàn)發(fā)育遲緩。

1例診斷為DD的9q34.3微缺失綜合征患兒，CMA技術(shù)檢測的致病性CNVs分析圖見圖3，該片段有一處缺失：arr[hg19] 9q34.3(140,434,785-141,018,648)x1，大小為0.58 Mb，包含OMIM基因數(shù)6個(gè)?；純簽榕ⅲ?4個(gè)月大，表現(xiàn)發(fā)育遲緩。

3 討論

隨著二胎政策的放開，高齡產(chǎn)婦的增多，孕期暴露風(fēng)險(xiǎn)因素的可變性，越來越多的家庭迎來了第二個(gè)寶寶的同時(shí)NDDs兒童的數(shù)量也在逐年增長，NDDs的發(fā)病率因疾病類型不同差異較大，但整體受累人群比例較高。以ASD為例，全球人口發(fā)病率約為0.6%[15]，因我國人口眾多，NDDs對我國兒童的健康帶來巨大的威脅，且至今無有效的治療方法，不僅給家庭帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)，也給社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，同時(shí)嚴(yán)重影響人口素質(zhì)。CNVs是導(dǎo)致DD/ID及ASD等NDDs發(fā)病的遺傳學(xué)因素之一，而目前西方發(fā)達(dá)國家對CNVs的研究主要采用CMA技術(shù)，該技術(shù)已成為DD/ID、多發(fā)畸形及ASD等疾病的一線診斷實(shí)驗(yàn)[10]，但CMA技術(shù)在我國起步較晚，本研究旨在探討CMA技術(shù)在發(fā)掘NDDs遺傳學(xué)因素中的應(yīng)用，同時(shí)為本地區(qū)建立一套完整的基因診斷路徑，為以后兒科遺傳疾病的遺傳分析提供指導(dǎo)。

染色體異常和基因組相關(guān)的微缺失微重復(fù)是NDDs患兒重要的遺傳學(xué)病因，常染色體顯性遺傳占智力障礙或全面發(fā)育遲緩比例為13%～39%[2]，新生突變是導(dǎo)致重度智力障礙或全面發(fā)育遲緩的重要病因[16]。常染色體隱性遺傳占智力障礙或全面發(fā)育遲緩比例為10%～20%[17]。本研究顯示，CMA對ASD患兒的分子診斷率為3.64%，CMA對DD/ID患兒的分子診斷率為26.67%,診斷水平高于有研究[18]已報(bào)道的CMA對DD/ID分子診斷率14.7%；低于CMA對ASD分子診斷率12%，高于劉欣等[3]已報(bào)道的CMA對DD/ID分子診斷率26.3%。分析原因主要為兩個(gè)方面，一是納入標(biāo)準(zhǔn)不同，劉欣等的納入標(biāo)準(zhǔn)為診斷為ASD、DD/ID、學(xué)習(xí)障礙、注意力缺失/多動(dòng)癥(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)的患兒及部分伴有面容異常或多發(fā)畸形的患兒，納入病種比本研究多樣。二是地域之間的差異。該結(jié)果對本地區(qū)的NDDs患兒臨床分子診斷，干預(yù)方面具有指導(dǎo)意義。

本研究在101例NDDs病人中檢出的18個(gè)病理性及可能致病性CNVs中包括3個(gè)已知的NDDs致病性熱點(diǎn)區(qū)域，即1q21.1q21.2、15q11.2q13.1、7q11.23，與國外已報(bào)道的情況[18]類似，說明這些已鑒定的熱點(diǎn)變異同樣在我國兒童NDDs的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。對檢測結(jié)果為臨床意義未知CNVs的8個(gè)病例中，4例患兒發(fā)現(xiàn)了與已報(bào)道的神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因變異，分別是：BRAF、ANKRD11、FANCA、AMER1、GPC3。WU等[19]報(bào)道Noonan綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，主要臨床表現(xiàn)為先天性心臟病、身材矮小、特殊面容、發(fā)育遲緩、凝血功能障礙、骨骼畸形等，BRAF基因新生突變導(dǎo)致Noonan綜合征的發(fā)生。SACHAROW等[20]報(bào)道ANKRD11 基因突變所致KBG 綜合征,以廣泛發(fā)育遲緩(語言發(fā)育遲緩尤為突出)、顱面異常、上頜中切牙過大和骨骼異常為特征的罕見常染色體顯性遺傳性疾病。值得注意的是，人種間基因組的差異可能導(dǎo)致同一致病性位點(diǎn)在不同人群中的發(fā)生頻率出現(xiàn)明顯差異，比如Phelan-McDermid綜合征相關(guān)位點(diǎn)22q13微缺失在中國ID患兒中的發(fā)生明顯高于西方(1.7%和0.24%)[21]。這一現(xiàn)象表明建立我國患兒NDDs致病性CNVs譜系數(shù)據(jù)庫對有效開展相關(guān)領(lǐng)域研究的重要性和必要性。

我們對DD/ID病人檢出的14個(gè)致病性CNVs分析發(fā)現(xiàn)與XU等[18]已報(bào)道的一些經(jīng)典的綜合征位點(diǎn)如1q21.1q21.2、15q11.2q13.1、7q11.23相吻合。另外，我們還發(fā)現(xiàn)1例X染色體異常的發(fā)育遲緩患兒；人類全基因組有25 000個(gè)功能基因(目前仍在增加中)，其中X染色體上有829個(gè)，僅占人類基因組基因的3.3%，然而10%～15%的精神發(fā)育遲滯與X染色體基因/基因組變異有關(guān)[22]，所以本例中的發(fā)育遲緩患兒可能與其染色體異常密切相關(guān)。另外我們還發(fā)現(xiàn)1例9q34.3微缺失綜合征，研究[23]表明9q34.3微缺失綜合征主要臨床表型包括智力低下、發(fā)育遲緩、語言發(fā)育障礙、肌張力低下、特殊面容(如眼距增寬、鼻孔前傾、濃眉)，部分病人可能出現(xiàn)新生兒喂養(yǎng)困難、食管反流、癲癇、心臟畸形及肥胖表型[23]。本研究中的9q34.3微缺失綜合征患兒有相似癥狀。另外9號染色體上不同區(qū)段的重復(fù)臨床表型也會(huì)不同，9p22.1-p22.3區(qū)域重復(fù)與特殊面容有關(guān)，9p21.2-21.3區(qū)域重復(fù)與語言發(fā)育落后有關(guān)，9p22.3-24區(qū)域的重復(fù)與智力低下有關(guān)[24-25]。

ASD病因復(fù)雜，近年來研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，CNVs在ASD病因中的構(gòu)成比為10%～20%。靜進(jìn)等[28]研究發(fā)現(xiàn)ASD病人染色體異常包括2q24缺失、3p14缺失和重復(fù)、1p36缺失、3q27～3q28缺失、7p21缺失等，涉及的易感基因包括MET、RELN、FOXP2、NRP2、PTEN、TsC1/Tsc2等。另外有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)EN2、RELN、NRP2、OXTR、GluR6和FOXP2基因的突變或多態(tài)性可能與中國人的ASD有關(guān)[29]。該研究中對ASD患兒檢測出2例染色體異常包含3個(gè)CNVs分別是：8p23.3p23.1缺失、8q24.23q24.3重復(fù)、Xp22.32p22.31缺失。其中1例患兒在8號染色體上同時(shí)發(fā)現(xiàn)缺失片段及重復(fù)片段。與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的OMIM基因有：MCPH1、CLN8、TRAPPC9、GPAA1、PUF60、NLGN4。DUERINCKX等[30]的研究表明常染色體隱性智力缺陷(Autosomal recessive intellectual disability，ARID)是智力缺陷的非常不同的亞組，而TRAPPC9和MCPH1的每個(gè)突變都會(huì)導(dǎo)致一種ARID。LOW等[31]研究發(fā)現(xiàn)12例病人中觀察到的臨床和分子數(shù)據(jù)表明PUF60的變異導(dǎo)致以身材矮小為特征的綜合征，發(fā)育遲緩、面部畸形等。還有學(xué)者[32]報(bào)道了5個(gè)新發(fā)的PUF60變異與偶發(fā)的ID患兒常見先天性異常相關(guān)的?；谝陨涎芯?，我們認(rèn)為TRAPPC9、MCPH1和PUF60可能是導(dǎo)致ASD發(fā)病的原因，關(guān)于他們的致病機(jī)制需要進(jìn)一步研究。