周旋，譚志團，任翼，陳秋麗，吳虹，虞道銳

哮喘是一種以氣道阻塞和高反應性為特征的肺部慢性炎癥性疾病，據(jù)統(tǒng)計全球約有3.4億不同年齡段的哮喘患者，其中約有1.54億為兒童患者［1］，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前在我國約有2 000萬哮喘患者，發(fā)病率高達3.0%［2］。兒童哮喘患者具有遷延難愈、反復發(fā)作等特點，嚴重者可影響患兒的生長發(fā)育和生活質量，甚至死亡［3］。目前藥物性防治是提高兒童哮喘患者生存質量和生存率的重要途徑。柚皮素（Naringenin）是一種二氫黃酮類的單體化合物，主要存在于蕓香科植物中，如葡萄柚、西紅柿、葡萄以及柑橘類等，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調節(jié)脂肪、抗衰老等多種生物學作用［4］。雖然既往有文獻表明柚皮素有一定的抗哮喘作用［5］，但是其抑制哮喘炎癥反應的藥效作用及機制仍需進一步研究。

核因子κB（NF-κB）是一種多效性轉錄因子，已發(fā)現(xiàn)其在哮喘模型和哮喘患者發(fā)病過程中具有誘導作用［6］。有研究表明NF-κB調控輔助性T2（Th2）細胞因子白細胞介素（IL）-1β、IL-4、IL-5等與哮喘的發(fā)病機制密切相關，并且由NF-κB調控的細胞因子也能促進NF-κB在哮喘患者肺部中的表達，加重哮喘的氣道炎癥反應［7］。另外，NF-κB的激活也與氣道組織重塑，即氣道周圍組織纖維化、平滑肌細胞增生及肥大、黏液生成等有著密切聯(lián)系［8］。本研究擬用卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）誘導建立哮喘大鼠模型，探討柚皮素對哮喘大鼠氣道炎癥反應的影響，并驗證其作用機制是否與抑制NF-κB信號通路有關，為兒童哮喘的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 柚皮素購自上海麥克林生化科技有限公司，純度≥98%；Sprague-Dawley（SD）大鼠購自上海斯萊克有限公司；OVA、吉姆薩（Giemsa）染色液、蘇木精、伊紅購于美國Sigma公司，氫氧化鋁凝膠溶液購于Thermo公司；抗NF-κB p65、抗NF-κB p50、抗NF-κB抑制蛋白α（IκBα）及β-Actin單克隆兔抗人抗體（細胞實驗）和單克隆兔抗鼠抗體（動物實驗）購于英國Abcam公司；山羊抗兔或者山羊抗鼠二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測定試驗（ELISA）試劑盒購自美國Minneapolis公司；RNA提取試劑盒購自Generay公司；PCR試劑盒購自Vazyme公司；A549細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；細胞培養(yǎng)基、血清、雙抗購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、ECL發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術公司。RT-PCR儀為CFX connect Real-Time PCR System；顯微鏡BX43型（OLYMPUS公司）；電泳系統(tǒng)為Mini-Proten Tetra System（Bio-Rad公司）；凝膠成像儀為ChemiDocXRS+System（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 OVA哮喘大鼠模型及實驗分組 取SD大鼠22只，體質量160~180 g，采用隨機數(shù)字表法取5只為正常對照組，將余下17只哮喘大鼠造模，第1天和第8天大鼠腹腔注射10 mg OVA和100 mg氫氧化鋁凝膠，第14天開始用2%的OVA溶液霧化激發(fā)，每日1次，每次30 min，連續(xù)10 d。分別在霧化第7天和第10天各取1只進行模型驗證，剩下15只采用隨機數(shù)字表法分為哮喘模型組、柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組，每組5只。柚皮素組連續(xù)灌胃柚皮素7 d，哮喘模型組給予同體積的生理鹽水。所有大鼠飼喂標準的嚙齒動物飼料和滅菌二級超純水，攝食環(huán)境為明暗12 h循環(huán)，溫度22~25℃，濕度40%~70%，實驗環(huán)境適應7 d。

1.2.2 Giemsa染色對支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎性細胞分類及計數(shù) 給藥結束后第2天，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉脫頸處死哮喘大鼠。留置導管至哮喘大鼠右肺，并固定，用預冷的PBS灌洗右肺3次，1 mL/次，取新鮮肺灌洗液樣本共2.4 mL，于4℃1 500 r/min離心10 min，棄上清液，100μL pH=7.4的PBS重懸細胞沉淀，取0.1μL重懸液滴于載玻片上，常溫晾干，制成涂片，甲醇固定10 min，將涂片浸入Giemsa染液中常溫染色20 s，純凈水洗1 min，將切片浸入1%醋酸溶液分化數(shù)秒，純凈水清洗，顯微鏡下鏡檢并計數(shù)。

1.2.3 肺組織病理學觀察和免疫組化染色 取左肺下葉于4%甲醛溶液中固定5 d，修整組織為適當?shù)男螤罴昂穸?，梯度乙醇進行脫水處理，二甲苯透明、浸蠟、包埋，切片厚度為4μm，切片放入65℃恒溫箱中6~12 h，常溫保存。（1）HE染色：二甲苯和乙醇脫蠟復水；將切片浸入蘇木精染液中常溫染色5 min，自來水洗1 min；將切片浸入1%鹽酸乙醇溶液10 s，純凈水清洗至組織返藍；將切片浸入伊紅染液中染色5 min，純凈水洗去玻片上的浮色；無水乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。（2）免疫組化：二甲苯和乙醇脫蠟復水；3%H2O237℃孵育15 min阻斷、滅活內源性過氧化物酶；PBS沖洗3次；置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）中水煮10 min修復抗原，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次；滴加NF-κB p65和NF-κB p50一抗置4℃冰箱孵育過夜，轉至室溫平衡30 min，PBS沖洗；滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB反應染色，顯微鏡下觀察反應進度，純凈水清洗，蘇木素復染，干燥，封片，拍照。

1.2.4 ELISA檢測Th2和NF-κB細胞因子的含量 取大鼠新鮮BALF，按ELISA試劑盒說明書檢測BALF中IL-4、IL-5和IL-15的含量。取下腔靜脈血，室溫靜置2 h后，在4℃下以3 000 r/min離心10 min以收集血清，按照ELISA試劑盒說明 書 檢測 血 清 中NF-κB p65、NF-κB p50、IκBα的含量。

1.2.5 qPCR檢測NF-κB相關基因mRNA表達 Trizol-離心柱法提取左肺上葉總RNA并進行純度測定和定量；按5×HiScript?ⅡqRTSuperMix 4μL、總RNA（≤1 000 ng）6μL、RNase Free dH2O補齊至20μL配制逆轉錄反應體系；50℃干浴15 min；85℃2 min終止反應；-20℃保存cDNA。引物序列：內參U6上游5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'；NF-κB p65上游5'-AGGATTTCGATTCCGCTACG-3'，下游5'-CTCACAGTGCTT?GCCCACC-3'；NF-κB p50上 游5'-GGCAGCACTCCTTAT?CAACC-3'，下游5'-GAGGTATCGTCCCATCGTAG-3'；IκBα上游5'-TGACCATGGAAGTGATTGGTCAG-3'，下游5'-GAT?CACAGCCAAGTGGAGTGGA-3'。qPCR擴增：PCR擴增反應體系2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10μL，上、下游引物各0.6μL，cDNA（稀釋至一致水平）8.8μL。qPCR反應條件：95℃30 s；95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)，熔解曲線70~95℃。PCR反應結束后讀取Ct值，利用軟件Opticon Monitor進行分析，采用2–ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

1.2.6 細胞培養(yǎng)及細胞炎癥模型建立 A549細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達60%左右時，用0.25%Trypsin-EDTA消化傳代。脂多糖（LPS）誘導細胞炎癥模型：選對數(shù)生長期的A549細胞，接種在6孔板內，待細胞貼壁后，用LPS（100μg/L）刺激細胞6 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)做后續(xù)實驗。實驗分為正常對照組、LPS組、LPS+柚皮素20μmol/L組、LPS+柚皮素40μmol/L組。

1.2.7 免疫熒光檢測NF-κB相關蛋白的表達 按1.2.6條件處理細胞后用PBS清洗細胞，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗，0.1%Triton100室溫破裂細胞膜20 min，PBS清洗3次，1%FBS室溫封閉30 min，PBS清洗，加入NF-κB p65、NF-κB p50、IκBα單克隆抗體（1∶1 000），4℃過夜，PBS清洗3次，按1∶1 000加入二抗，4℃避光孵育2 h，PBS清洗3次，加入濃度為10μg/L的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核，4℃避光孵育20 min，PBS清洗3次；熒光倒置顯微鏡拍照。

1.2.8 Western blot檢測NF-κB相關蛋白表達 按1.2.6條件處理并收集細胞，用RAPI裂解液裂解細胞，在4℃下14 000 r/min低溫離心30 min，收集上清液作為總蛋白。使用BCA蛋白測定試劑盒測定樣本中蛋白濃度。10%SDS-PAGE，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗3次。分別與NF-κB p65、NF-κB p50、IκBα（1∶1 000）、β-actin單克隆抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，與IgG（1∶2 000）二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光試劑盒顯色，凝膠圖像采集及分析，Image J軟件分析條帶相應的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，2組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 柚皮素減少哮喘大鼠肺部炎性細胞浸潤 結果顯示，與正常對照組比，哮喘模型組、柚皮素100 mg/kg組和200 mg/kg組的炎性細胞總數(shù)、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞以及哮喘模型組、柚皮素100 mg/kg組淋巴細胞數(shù)均升高（P＜0.05）；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組炎性細胞總數(shù)、中性粒細胞降低，柚皮素200 mg/kg組炎性細胞總數(shù)、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞以及淋巴細胞數(shù)均降低（均P＜0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of the number of inflammatory cells in BALF between the four groups表1 各組BALF中炎性細胞數(shù)比較（n=5，×104個/mL，±s）

Tab.1 Comparison of the number of inflammatory cells in BALF between the four groups表1 各組BALF中炎性細胞數(shù)比較（n=5，×104個/mL，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與哮喘模型組比較，P＜0.05；表2~4同

?

2.2 柚皮素減輕哮喘大鼠肺組織和支氣管炎癥反應 HE染色顯示正常對照組大鼠的肺組織和氣管結構未見明顯異常；哮喘模型組大鼠的肺組織可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁明顯增厚，肺泡腔縮小甚至塌陷，部分肺泡過度擴張；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組大鼠肺部炎性細胞浸潤明顯減少，可見少量嗜酸性粒細胞，局部肺泡壁輕度增厚，多數(shù)肺泡結構正常，可見少數(shù)肺泡擴張，見圖1。哮喘模型組大鼠的支氣管可見黏膜水腫，黏膜上皮脫落，假復層結構消失，黏膜下層組織水腫、血管充血，并伴有大量炎性細胞浸潤；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組大鼠的支氣管炎性細胞浸潤明顯減少，黏膜上皮及纖毛結構相對正常，氣道黏膜及黏膜下層可見少許脫落，見圖1。

Fig.1 HE staining of the pathological changes of lung tissue and bronchus(×400)圖1 HE染色觀察肺組織和支氣管病理學變化（×400）

肺組織病理評分結果顯示，與正常對照組比較，哮喘模型組肺組織病理評分升高（P＜0.05）；與哮喘模型組比較，柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組的肺組織病理評分明顯降低（P＜0.05），見圖2A。氣管組織病理評分結果顯示，與正常對照組比較，哮喘模型組支氣管組織病理評分升高（P＜0.05）；與哮喘模型組相比，柚皮素100 mg/kg組支氣管組織病理評分差異無統(tǒng)計學意義，而柚皮素200 mg/kg組出現(xiàn)降低（P＜0.05），見圖2B。

Fig.2 Comparison of pathological scores of lung tissue and bronchus of rats in each group圖2 各組大鼠肺組織和支氣管組織病理評分比較

2.3 柚皮素抑制哮喘大鼠肺部Th2細胞因子的表達 與正常對照組比較，哮喘模型組大鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13的含量升高（均P＜0.05）；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組大鼠肺部組織IL-4、IL-5、IL-13的含量明顯降低（均P＜0.05）。見表2。

2.4 柚皮素抑制哮喘大鼠NF-κB通路活性 ELISA結果顯示，與正常對照組相比，哮喘模型組大鼠血清NF-κB p65、NF-κB p50的含量升高，IκBα含量下降（P＜0.05）；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組NF-κB p65和NF-κB p50的含量均明顯降低（P＜0.05），柚皮素200 mg/kg組大鼠血清NF-κB p65、NF-κB p50降低，IκBα的含量升高（P＜0.05），見表3。肺部免疫組化結果顯示，大鼠哮喘模型組中NFκB p65、NF-κB p50的表達較正常對照組明顯增多，而柚皮素100 mg/kg和200 mg/kg組哮喘大鼠肺部組織NF-κB p65、NF-κB p50的表達顯著低于哮喘模型組，見圖3、4。

Tab.2 Comparison of the contents of Th2 cytokines IL-4,IL-5,and IL-13 in BALF between the four groups表2 各組BALF中Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-13的含量比較 （n=5，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of the contents of Th2 cytokines IL-4,IL-5,and IL-13 in BALF between the four groups表2 各組BALF中Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-13的含量比較 （n=5，ng/L，±s）

?

Tab.3 Comparison of the content of NF-κB related proteins in intravenous serum of rats betweenthe four groups表3 各組大鼠靜脈血清中NF-κB相關蛋白的含量比較（n=5，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of the content of NF-κB related proteins in intravenous serum of rats betweenthe four groups表3 各組大鼠靜脈血清中NF-κB相關蛋白的含量比較（n=5，ng/L，±s）

?

qPCR結果表明，與正常對照組比較，哮喘模型組大鼠肺部NF-κB p65、NF-κB p50的mRNA表達水平升高，IκBα的mRNA表達水平下降（P＜0.05）；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組和200 mg/kg組哮喘大鼠肺部NF-κB p65和NF-κB p50的mRNA表達水平均下降（P＜0.05），IκBαmRNA表達水平變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

Fig.3 Immunohistochemical detection of lung NF-κB protein expression in asthmatic rats(×400)圖3 免疫組化檢測哮喘大鼠肺部NF-κB蛋白的表達（×400）

Fig.4 Histochemical score of relative expression of NF-κB protein in lungs of asthmatic rats圖4 哮喘大鼠肺部NF-κB蛋白相對表達的組織化學評分

Tab.4 Comparison of the expression levels of NF-κB related gene mRNA in lung tissues of rats between the four groups表4各組大鼠肺組織中NF-κB相關基因mRNA的表達水平比較 （n=5，±s）

Tab.4 Comparison of the expression levels of NF-κB related gene mRNA in lung tissues of rats between the four groups表4各組大鼠肺組織中NF-κB相關基因mRNA的表達水平比較 （n=5，±s）

?

2.5 柚皮素抑制LPS誘導A549細胞NF-κB的表達 Western blot結果表明，與正常對照組比，LPS組NF-κB p65、NF-κB p50蛋白表達水平升高，IκBα蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與LPS組比，LPS＋柚皮素20μmol/L組和LPS＋柚皮素40μmol/L組NF-κB p65、NF-κB p50蛋白表達水平降低，IκBα蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖5、6。免疫熒光結果表明，與正常對照組相比，A549細胞經(jīng)LPS誘導后NFκB p65、NF-κB p50蛋白的表達水平升高，IκBα的表達降低；與LPS組相比，當用20μmol/L和40μmol/L的柚皮素處理A549細胞后NF-κB p65和NF-κB p50的表達降低，而IκBα的表達升高，見圖7。

Fig.5 Expressions of NF-κB related proteins in A549 cells detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測A549細胞中NF-κB相關蛋白的表達

Fig.6 Comparison of relative expressions of NF-κB pathway related proteins between four groups圖6 各組NF-κB通路相關蛋白的相對表達量比較

Fig.7 Immunofluorescence detection of NF-κB related protein expressions in A549 cells(×400)圖7 免疫熒光檢測A549細胞中NF-κB相關蛋白的表達水平（×400）

3 討論

3.1 天然藥物治療哮喘的新思路 研究顯示，在我國大陸地區(qū)僅有2.5%左右哮喘兒童的癥狀得到控制，而該數(shù)據(jù)并未達到全球哮喘防治創(chuàng)議指南要求［9］。減少哮喘患兒慢性持續(xù)期和臨床緩解期的氣道慢性炎癥可降低哮喘的發(fā)作頻率［10］，慢性持續(xù)期的防治又是降低小兒哮喘發(fā)病率的重要舉措。天然單體藥具有來源廣、低毒、安全、經(jīng)濟等特點，是開發(fā)小兒哮喘慢性持續(xù)期治療藥物的重要方向。據(jù)報道多種天然藥物具有改善氣道炎癥的潛在作用，如黃芩苷可減輕哮喘炎癥和氣道高反應性［11］，白花前胡甲素能改善哮喘氣道重塑［12］，表兒茶素沒食子酸酯可抑制氣道炎癥和上皮-間質轉化［13］等。本研究顯示，柚皮素可減少哮喘大鼠肺部單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，改善肺泡的生理結構，減少黏膜上皮脫落，促進支氣管假復層及纖毛結構修復，與以往報道的柚皮素可減輕哮喘炎癥、改善氣道高反應性和氣道重塑的結果一致［5］，提示柚皮素具有成為小兒哮喘防治藥物的潛力。

3.2 柚皮素抑制Th2細胞因子的作用 Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-13與哮喘的發(fā)病有著密切聯(lián)系，IL-4可促進血管內皮細胞黏附分子的表達，使嗜酸性粒細胞在炎癥部位聚集、浸潤，形成氣道炎癥［14］；IL-5對于嗜酸性粒細胞的分化、成熟以及在變應原誘導的嗜酸性粒細胞氣道炎癥中起重要作用［15］；而IL-13可以促進B細胞分化，直接導致氣道炎癥和氣道高反應［16］。本研究發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-5、IL-13在哮喘模型組肺組織中高表達，而柚皮素能有效降低3種炎性因子的表達，表明其可能通過抑制Th2細胞因子的促炎作用改善哮喘炎癥反應。

3.3 柚皮素經(jīng)NF-κB信號通路發(fā)揮抗哮喘的作用 NF-κB通路活化是哮喘發(fā)病的重要作用機制之一，當肺或支氣管受各類因素刺激后，細胞質的IκBα解除對NF-κB p65/NF-κB p50二聚體的抑制作用，IκBα磷酸化降解，NF-κB p65/NF-κB p50二聚體從細胞質解離進入細胞核，促進促炎性細胞因子的合成和釋放［17］。因此NF-κB通路有望成為哮喘治療的潛在靶點。研究發(fā)現(xiàn)多種單體天然藥物可在哮喘大鼠靶向作用于NF-κB通路，如甘草次酸可以通過抑制NF-κB的表達，降低炎癥介質IL-5、IL-6等的表達，改善大鼠氧化應激狀態(tài)［18］；雷公藤內酯醇可抑制IκB激酶α（IκB kinase-α，IKK-α）及p-IκB的表達，減少細胞因子和趨化因子的釋放與產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗哮喘的作用［19］。本研究顯示，在哮喘大鼠模型中NF-κB p65、NF-κB p50高表達、IκBα低表達，而柚皮素能下調NF-κB p65、NF-κB p50，上調IκBα。另外，為進一步闡明柚皮素抑制NF-κB通路的作用，本研究利用LPS誘導建立A549細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)柚皮素可抑制LPS-A549細胞質中NF-κB相關蛋白的表達，逆轉IκBα的表達；同樣Yang等［20］也發(fā)現(xiàn)在中性粒細胞彈性蛋白酶誘導的呼吸道上皮細胞炎癥模型中，柚皮素可抑制NF-κB信號通路的活性。這就提示NF-κB參與哮喘的進程，而柚皮素可降低NF-κB信號通路的活性是其發(fā)揮防治哮喘作用的潛在機制。

綜上所述，本研究結果表明柚皮素具有顯著抑制哮喘大鼠肺部和支氣管炎癥反應的作用，并在體內外模型中證實柚皮素發(fā)揮抗炎的潛在作用機制與抑制NF-κB信號通路有關，其有望成為治療哮喘慢性持續(xù)期的藥物。雖然柚皮素對哮喘大鼠具有良好藥效作用，但其藥效的安全性及其更深、更全面的作用機制并不十分清楚，在今后的研究工作中還需更深入的探討，為哮喘的藥物治療提供理論依據(jù)。