阮成群，肖永杰，李記天△

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是兒童和青少年最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，其發(fā)病率逐年升高［1］。目前常采用手術切除結合化療來控制腫瘤轉移，其中局部OS患者的5年生存率約為70%，而轉移或復發(fā)性患者的總體生存時間不足12個月［2］。所以，尋求新的治療策略及治療靶點至關重要。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA分子，可作為癌基因或抑癌因子發(fā)揮作用，從而調節(jié)癌細胞的生長增殖等行為。其中Linc00891參與調控多種細胞因子-細胞因子受體相互作用的信號通路［3］。LncRNA和微小RNA（miRNA）可相互調控，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。miR-27a-3p在OS細胞系中的表達顯著高于人正常成骨細胞［5］，且miR-27a-3p能夠通過激活Wnt/β-連環(huán)素（β-catenin）通路促進結直腸癌的進展［6］。但是，Linc00891能否通過競爭性結合并抑制miR-27a-3p在OS中發(fā)揮抑癌作用，目前相關研究較少。本研究通過檢測Linc00891在不同OS細胞系及人成骨細胞系中的表達情況并分析過表達Linc00891對OS細胞系增殖、克隆形成、遷移、上皮間質轉化的影響，同時探討Linc00891和miR-27a-3p的結合位點以及過表達Linc00891和上調miR-27a-3p對Wnt/β-catenin信號通路的影響，以期為OS的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨細胞系hFOB 1.19（目錄號：GNHu14）和OS細胞系U-2 OS（目錄號：SCSP-5030）、Saos-2（目錄號：TCHu114）、MG-63（目錄號：TCHu124）、SW 1353（目錄號：TCHu128）均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。DMEM/F12培養(yǎng)基和10%胎牛血清（FBS）均購自美國Giboc公司；CCK-8檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qPCR）檢測試劑盒、Linc00891過表達陰性對照載體（pcDNA-NC）和Linc00891過表達載體（pcDNALinc00891）以及Linc00891、β-actin引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；miR-27a-3p模擬物（miR-27a-3p mimic）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Lipofectamine 3000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；PVDF膜購自美國Sigma公司；ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；鈣黏著蛋白E（E-cadherin，E-cad）、鈣黏著蛋白N（N-cad）、GAPDH小鼠單克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠IgG二抗均購自英國Abcam公司；RNA pulldown試劑盒購自廣州賽誠生物科技有限公司；鏈霉親和素磁珠購自美國CST公司；TCF/LEF報告試劑盒購自北京啟為益成科技有限公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；TL988 qPCR儀購自西安天隆科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP購自山東三瑞科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) hFOB 1.19、U-2 OS、Saos-2、MG-63、SW 1353細胞系均使用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基并置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2~3 d傳代1次。

1.2.2 qPCR檢測不同OS細胞系和人成骨細胞系中Linc00891的表達水平 使用RNA提取試劑盒提取各種細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒得到cDNA并置于-20℃冰箱中保存待用。反應程序：94℃10 min；94℃30 s，62℃30 s，62℃30 s，40個循環(huán)。反應體系參照qPCR試劑盒說明書。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt計算不同細胞中Linc00891的相對表達水平。引物序列見表1。將Linc00891表達水平較低的2細胞系進行后續(xù)實驗。

Tab.1 qPCR primer sequences表1 qPCR引物序列

1.2.3 細胞轉染及分組 將1.2.2實驗篩選的細胞接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞長滿培養(yǎng)基后進行傳代。將Saos-2細胞、MG-63細胞分組為：blank組（不轉染）、NC組（轉染pcDNA-NC）和OE組（轉染pcDNA-Linc00891）。當細胞生長至50%~60%時，使用Lipfectamine 3000轉染試劑盒將pcDNA-NC、pcDNA-Linc00891分別轉染至Saos-2和MG-63細胞。轉染24 h后進行各指標檢測。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖能力 分別調整各組細胞濃度至3×104個/mL并取100μL細胞懸液接種于96孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2、24、48、72 h后分別加入CCK-8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標儀上測定450 nm波長的光密度（OD）值。

1.2.5 平板克隆法檢測細胞克隆形成能力 收集培養(yǎng)24 h后的各組細胞，胰蛋白酶消化后，配制成濃度為1×106個/L細胞懸液，取6孔板，每孔接種1 mL后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，至形成肉眼可見的克隆時（克隆細胞數(shù)100左右），終止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次后，每孔加入1 mL甲醇固定15 min，以流水緩慢沖洗，每孔再加入1 mL吉姆薩染液染色30 min。流水緩慢沖洗，于通風櫥干燥，顯微鏡下計數(shù)，計算細胞克隆形成相對水平。

1.2.6 Transwell小室檢測細胞遷移能力 取各組細胞，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基，制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×108個/mL，取100μL細胞懸液接種到Transwell小室上室，取600μL含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基至下室，37℃培養(yǎng)24 h后，下室用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌3次，甲醇固定15 min，0.1%結晶紫室溫染色40 min。沖洗多余染液，晾干后光學顯微鏡下觀察并計數(shù)穿過微孔膜的細胞，計算細胞遷移相對水平。

1.2.7 Western blot檢測E-cad、N-cad蛋白表達 各組細胞采用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉PVDF膜，脫脂奶粉封閉，1∶1 000濃度稀釋后的E-cad、N-cad和GAPDH小鼠單克隆抗體4℃過夜孵育、TBST緩沖液洗膜，HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶2 000）中室溫孵育2 h，洗膜，用ECL試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以GAPDH為內參，分析各組蛋白表達水平。

1.2.8 RNA pulldown實驗檢測Saos-2細胞中Linc00891和miR-27a-3p的結合關系 取3×106個細胞接種在10 cm培養(yǎng)皿上過夜培養(yǎng)，以終濃度100 nmol/L生物素標記的miR-27a-3p mimic（探針由Ribobio定制）轉染Saos-2細胞，對照組采用生物素標記的NC序列進行轉染。轉染48 h后收集細胞，在冰上加細胞裂解液，于4℃下旋轉孵育4 h；將50μL鏈霉親和素磁珠加入上述細胞裂解液后，在4℃下旋轉平衡30 min，離心并清洗收集磁珠，以Trizol法分別提取磁珠pulldown下的總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，進行PCR反應，總體系20μL包括10μL 2×EasyPfu PCR SuperMix、上下游引物各1μL，cDNA 1μL、ddH2O 7μL，反應程序：95℃5 min；94℃20 s，58℃20 s，72℃2 min，35個循環(huán)，檢測其中Linc00891水平，以GAPDH作為內參（上游引物5'-AAGTTCAACGGCACAGTCA-3'；下 游 引 物5'-GTCATA?AGTCCCTCCACGAT-3'）。以未經RNA pulldown的50μL細胞裂解液作為input對照。

1.2.9 TCF/LEF報告試劑盒檢測細胞內Wnt/β-catenin通路激活情況 TCF/LEF報告載體上載有由TATA box和TCF/LEF響應元件所調控的綠色熒光蛋白（GFP）基因，可通過檢測GFP蛋白表達水平間接反映β-catenin的轉錄活性，進而反映Wnt/β-catenin通路激活情況。野生型或Linc00891過表達細胞以2×104個細胞/孔的密度接種于96孔板，以反向轉染方法將50 ng TCF/LEF報告載體和50 ng miR-27a-3p mimic以Lipofectamine 3000進行共轉染，對照組僅轉染報告載體。轉染16 h后更換新鮮培養(yǎng)液體，轉染24 h后細胞以50 mmo/L氯化鋰處理，并以酶標儀在488/515 nm ex/em下檢測各孔熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism（Ver.8）軟件進行統(tǒng)計學分析。除標注外，各實驗均設置6個重復（3個生物學重復×2個技術重復），并將所有數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計學分析。各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。2組數(shù)據(jù)間采用t檢驗進行比較，多組數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析進行比較，組間多重比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Linc00891表達水平 qPCR結果表明，hFOB 1.19、U-2 OS、Saos-2、MG-63和SW 1353細胞系中Linc00891的相對表達水平分別為1.00±0.11、0.62±0.08、0.53±0.11、0.43±0.09和0.55±0.11。各OS細胞系Linc00891表達水平均明顯低于正常成骨細胞hFOB 1.19細胞系（n=6，F(xiàn)=28.541，P＜0.05）。其中，Saos-2和MG-63中Linc00891相對表達水平較低，因此選擇Saos-2和MG-63 OS細胞系進行后續(xù)研究。

2.2 CCK-8實驗檢測過表達Linc00891對OS細胞增殖的影響 結果顯示，Saos-2細胞在48 h和72 h時，與NC組和blank組比較，OE組細胞增殖能力顯著降低（P＜0.05）；MG-63細胞在24 h、48 h和72 h時，與NC組和blank組比較，OE組細胞增殖能力顯著降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Proliferation of Saos-2 and MG-63 cells at different time points in the three groups表2 各組Saos-2、MG-63細胞不同時間點增殖能力（n=6，OD450±s）

Tab.2 Proliferation of Saos-2 and MG-63 cells at different time points in the three groups表2 各組Saos-2、MG-63細胞不同時間點增殖能力（n=6，OD450±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與blank組比較，b與NC組比較，P＜0.05

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2.3 平板克隆實驗檢測過表達Linc00891對OS細胞克隆形成能力的影響 結果顯示，與NC組和blank組比較，OE組Saos-2和MG-63細胞克隆形成能力顯著降低（P＜0.05），見表3、圖1。

Tab.3 Comparison of colony forming ability of Saos-2 and MG-63 cells between the three groups表3 各組Saos-2和MG-63細胞克隆形成能力比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of colony forming ability of Saos-2 and MG-63 cells between the three groups表3 各組Saos-2和MG-63細胞克隆形成能力比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與blank組比較，b與NC組比較，P＜0.05

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2.4 Transwell實驗檢測過表達Linc00891對OS細胞遷移能力的影響 結果顯示，與NC組和blank組比較，OE組Saos-2和MG-63細胞遷移能力顯著降低（P＜0.05），見圖2、表4。

Fig.1 Clone formation of Saos-2 and MG-63 cells in each group圖1 各組Saos-2和MG-63細胞克隆形成情況

Fig.2 Migration levels of Saos-2 and MG-63 cells in each group(crystal violet stain,×200)圖2 各組Saos-2和MG-63細胞遷移水平（結晶紫染色，×200）

Tab.4 Comparison of migration ability of Saos-2 and MG-63 cells between the three groups表4 各組Saos-2和MG-63細胞遷移能力比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of migration ability of Saos-2 and MG-63 cells between the three groups表4 各組Saos-2和MG-63細胞遷移能力比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與blank組比較，b與NC組比較，P＜0.05

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2.5 各組細胞上皮間質轉化相關蛋白表達水平比較 Western blot實驗結果顯示，與NC組和blank組比較，OE組Saos-2和MG-63細胞N-cad/E-cad比值顯著降低（P＜0.05），見圖3、表5。

2.6 OS細胞Saos-2中Linc00891和miR-27a-3p的結合關系 RNA pulldown結果顯示，input-bio-N、pulldown-bio-NC、input-bio-miR-27a-3p和pull?down-bio-miR-27a-3p組中Linc00891相對值分別為1.00±0.10、0.01±0.00、1.00±0.12和0.92±0.09。與pulldown-bio-NC組比較，其余各組Linc00891相對值顯著升高（n=6，F(xiàn)=172.375，P＜0.05）。見圖4。

Fig.3 The N-cad and E-cad protein expression levels in Saos-2 and MG-63 cells in each group圖3 各組Saos-2、MG-63細胞N-cad、E-cad蛋白表達水平

Tab.5 N-cad/E-cad ratio in Saos-2 and MG-63 cells ineach group表5 各組Saos-2和MG-63細胞N-cad/E-cad比值（n=6，±s）

Tab.5 N-cad/E-cad ratio in Saos-2 and MG-63 cells ineach group表5 各組Saos-2和MG-63細胞N-cad/E-cad比值（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與blank組比較，P＜0.05，b與NC組比較，P＜0.05

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Fig.4 Binding relationship between Linc00891 and miR-27a-3p圖4 Linc00891和miR-27a-3p的結合關系

2.7 過表達Linc00891和上調miR-27a-3p對Wnt/β-catenin信號通路的影響 TCF/LEF報告試劑盒檢測結果顯示，與野生型細胞中GFP熒光強度（1.00±0.10）比較，過表達Linc00891細胞中GFP熒光強度（0.40±0.04）顯著降低（n=6，t=13.646，P＜0.05），轉染miR-27a-3p mimic細胞中GFP熒光強度（3.87±0.34）顯著升高（n=6，t=19.836，P＜0.05）；與過表達Linc00891細胞中GFP熒光強度比較，過表達Linc00891同時轉染miR-27a-3p mimic細胞中GFP熒光強度（2.01±0.37）顯著升高（n=6，t=10.597，P＜0.05）。見圖5。

Fig.5 Effects of overexpression of Linc00891 and up regulation of miR-27a-3p on Wnt/β-catenin signaling pathway圖5 過表達Linc00891和上調miR-27a-3p對Wnt/β-catenin信號通路的影響

3 討論

OS的發(fā)病率最高年齡段為15~19歲，且具有高轉移率這一顯著特點［7］。雖然近年來關于OS的基礎和臨床研究均取得了一定的進展，但相關分子生物學機制尚不清楚，因此缺乏有效的特異性生物靶向治療藥物。探討OS細胞潛在的分子機制是研究的熱點。

LncRNA是多種生物過程的重要調控因子［8］，其中LncRNA-miRNA-mRNA軸在OS的發(fā)展中起關鍵作用，可為癌癥的診斷和治療提供新的途徑［9］。本研究發(fā)現(xiàn)Linc00891在OS細胞中的表達水平顯著低于正常骨細胞，且過表達Linc00891可顯著抑制OS細胞在體外的增殖、克隆形成、遷移能力以及降低N-cad/E-cad比值，進而抑制細胞上皮-間質轉化，提示其可能在OS中發(fā)揮抑癌作用。袁建敏等［10］研究發(fā)現(xiàn)化療藥物順鉑可顯著抑制OS細胞U-2 OS增殖，促進其凋亡，然而OS易對鉑類藥物產生耐藥性，單一鉑類用藥會促進耐藥細胞的生長，因此順鉑、阿霉素、甲氨蝶呤聯(lián)合用藥或阿霉素和甲氨蝶呤聯(lián)合用藥是OS治療中常見的化療方案。梁宏彬等［11］研究發(fā)現(xiàn)激活Wnt/β-catenin通路可顯著提高卵巢癌細胞對鉑類組合藥物化療耐藥性，與腫瘤進展和患者的不良預后具有顯著相關性。本研究發(fā)現(xiàn)過表達Linc00891可顯著抑制Wnt/β-catenin信號通路，提示Linc00891可能通過抑制Wnt/β-catenin通路，降低OS細胞對鉑類組合藥物的化療耐藥性。此外，Wnt/β-catenin信號通路的激活對OS的進展起到關鍵作用：Wnt信號的異常激活可促進OS細胞的生長和轉移［12］，抑制Wnt/β-catenin信號通路可廣泛抑制OS細胞的生長，并誘導凋亡［13］。

LncRNA參與腫瘤細胞中諸生物學過程的最主要機制是競爭性結合miRNA并抑制后者的功能［14］。本研究前期通過ENCORI網站檢索了有AGO CLIPseq數(shù)據(jù)支持的可能與Linc00891發(fā)生相互作用的miRNA，發(fā)現(xiàn)Linc00891和miR-27a-3p可發(fā)生相互作用，并且通過進一步研究發(fā)現(xiàn)Linc00891和已知對OS進展有明確促進作用的miR-27a-3p存在直接的相互作用，且miR-27a-3p mimic轉染可克服過表達Linc00891對OS細胞中Wnt/β-catenin通路的抑制作用，提示Linc00891可能抑制miR-27a-3p在OS細胞中的功能。miR-27a-3p可在卵巢癌［15］、乳腺癌［16］、膠質瘤［17］和胰腺導管腺癌［18］中提高Wnt/β-catenin通路的激活水平，這一點也在本研究的OS細胞中得到證實，因此筆者推斷Linc00891可能是通過競爭性結合miR-27a-3p并抑制其對Wnt/β-catenin通路的激活作用。除此之外，miR-27b-3p在乳腺癌細胞中可通過CBLB/GRB2途徑促進癌細胞的增殖并提高多藥耐藥性［19］，在結直腸癌細胞中通過靶向HOXA10促進癌細胞的遷移和侵襲［20］。Linc00891是否對上述途徑發(fā)揮類似的作用以及Linc00891與OS的臨床相關性值得進一步研究，其在其他腫瘤中可能發(fā)揮的作用亦值得探索。本研究未對Linc00891對OS的抑癌作用進行體內實驗驗證，也未驗證Linc00891是否通過其他途徑發(fā)揮抑癌作用。

綜上，本研究揭示了Linc00891在OS中的抑癌作用，而其發(fā)揮抑癌作用的機制可能是通過競爭性結合miR-27a-3p并抑制其對Wnt/β-catenin通路的激活，進而抑制癌細胞增殖、遷移和上皮間質轉化。