閆軍 周高晉 馬博

結(jié)腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一，中晚期病人療效不佳，預(yù)后差。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲及預(yù)后中發(fā)揮重要的作用，與結(jié)腸癌細胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[1]。腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC)是腫瘤復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥的根源，已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)CSCs的存在[2]。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs參與調(diào)控結(jié)腸癌干細胞的惡性生物學(xué)行為[3]。miR-711是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，在多種惡性腫瘤組織中低表達[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-711能抑制SGC-7901胃癌細胞的干性指標SOX2的表達，同時抑制與腫瘤耐藥相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達[7]。我們從TCGA及Metabolic gEne Rapid Visualizer等數(shù)據(jù)庫分析顯示，結(jié)腸癌組織中miR-711低表達，正常結(jié)腸組織中高表達。但是miR-711是否可影響結(jié)腸癌干細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT過程目前尚不清楚。本研究分析miR-711對結(jié)腸癌干細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖及EMT過程的影響。

材料與方法

一、主要試劑、細胞株及儀器

人結(jié)腸癌細胞株HT-29、Caco-2、HCT116、LOVO和HCT8(上海生命科學(xué)研究所)。miR-711 mimics、miR-NC對照質(zhì)粒(上海生物工程公司)；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(Jackson公司，美國)；FITC-CD44單克隆抗體、PE-CD133單克隆抗體(Abcam公司，美國)；Western Blot試劑盒，RNA提取試劑盒，轉(zhuǎn)染試劑盒(上海碧云天生物公司)；MTT試劑盒(Kapa Biosystems，美國)；二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、Transwell小室、PCR試劑盒(Sigma公司，美國)；酶標儀(上海儀電分析儀器有限公司)；ABI 7900PCR擴增儀(上海儀電分析儀器有限公司)；FACS流式細胞儀(BD Biosciences，美國)。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：含10% FBS和青、鏈霉素各100 U/L的RPMI1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后，用0.25%胰酶消化，制備單細胞懸液，使用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基、傳代。光學(xué)顯微鏡下觀察細胞球情況。

2.流式細胞儀分選腫瘤干細胞：選取第3代細胞，0.25%胰酶消化，調(diào)整濃度為1×106/L的單細胞懸液，接種于6孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔，加入FITC-CD44和PE-CD133單克隆抗體，4 ℃避光孵育30分鐘，流式細胞儀檢測CD44+/CD133+細胞百分比。

3.細胞轉(zhuǎn)染：使用Lipofeetamine 2000試劑對分選的腫瘤干細胞進行轉(zhuǎn)染，分為：空載組(轉(zhuǎn)染miR-NC)，miR-711過表達組(轉(zhuǎn)染miR-711-mimics)及空白組(未轉(zhuǎn)染腫瘤干細胞)。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

4.各組細胞miR-711 mRNA表達的檢測采用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)。取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化，離心。利用Trizol試劑提取細胞總RNA，測定RNA濃度，將合格的總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行PCR擴增。上海生物公司根據(jù)Gene Bank序列合成目標引物序列(表1)，根據(jù)反應(yīng)要求配置反應(yīng)體系，包括SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μl+上下游引物10 μm各1 μl，加反應(yīng)水至總體積為25 μl。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為92 ℃ 20秒、96 ℃ 2秒、85 ℃ 20秒、80 ℃ 6秒，共40個循環(huán)，75 ℃讀取熒光，構(gòu)建溶解曲線。2-△△Ct法計算目標引物mRNA的相對表達量。

表1 目標引物序列和大小

5.細胞增殖能力檢測采用MTT法。將各組細胞接種于96孔板中，細胞濃度調(diào)整為5×103個/孔，培養(yǎng)24小時，分別于培養(yǎng)后12小時、24小時、48小時和72小時，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后酶標儀測量OD值。抑制率=(對照組OD-實驗組OD)/對照組OD×100%。

6.Transwell小室實驗檢測細胞遷移、侵襲能力：采用無Matrigel基質(zhì)膠和有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室分別進行細胞遷移和侵襲實驗。遷移實驗：上室每孔加入200 μl無血清細胞懸浮液，密度為6×104個/孔，下室加入600 μl含20%血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時，4%多聚甲醛固定10分鐘，0.5 %結(jié)晶紫染色10分鐘。洗滌，光學(xué)顯微鏡下選取5個視野計算細胞數(shù)量。侵襲實驗：使用4 ℃的無血清DMEM1∶6稀釋基質(zhì)膠，每個transwell小室中加40 μl Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃放置30 min。取出小室吸取多余的液體，其余步驟同遷移實驗。

7.Western Blot檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白量表達：去除培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入裂解液，冰浴30分鐘，40 ℃ 1 500 r/min離心5分鐘，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μl待測。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，封閉液封閉1小時，逐次兔抗人E-cadherin(1∶150)、N-cadherin(1∶100)、Vimentin(1∶100)、β-actin(1∶100)多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(1∶100)。曝光成像，Image Lab Software測定光密度。結(jié)果以目標蛋白光密度值/β-actin光密度值表示。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

1.流式細胞術(shù)檢測人結(jié)腸癌細胞株中CD44+/CD133+表達見圖1、2。結(jié)腸癌細胞株HT-29、Caco-2、HCT116、LOVO和HCT8細胞表面CD44+/CD133+百分比分別為29.00%，0.410%，24.100%，0.135%，0.970%，細胞株HT-29細胞CD44+/CD133+百分比最高，因此我們選取HT-29細胞株用于隨后的實驗研究。

圖1 流式細胞儀分析結(jié)腸癌細胞株HT-29、Caco-2、HCT116、LOVO和HCT8細胞表面CD44+/CD133+百分比

圖2 結(jié)腸癌細胞株HT-29、Caco-2、HCT116、LOVO和HCT8細胞表面CD44+/CD133+百分比

2.各組miR-711mRNA表達見圖3。miR-711過表達組細胞miR-711mRNA水平高于空載組、空白組(P<0.05)。

與過表達組比較，aP<0.05

3.miR-711過表達對細胞增殖能力的影響見表2。兩組0小時細胞抑制率比較無差異，過表達組培養(yǎng)12小時、24小時、48小時和72小時的細胞抑制率明顯高于空白組，空載組(P<0.05)。

表2 各組細胞抑制率比較

4.miR-711過表達對細胞侵襲、遷移能力的影響見圖4。miR-711過表達組細胞侵襲能力低于空載組、空白組(t=8.215，9.042，P均<0.001)。miR-711過表達組細胞遷移能力低于空載組、空白組(t=6.483，7.941，P均<0.001)。

與過表達組比較，aP<0.05

5.miR-711過表達對E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響見圖5。miR-711過表達組E-cadherin蛋白水平(0.45±0.05)高于空載組(0.35±0.03)、空白組(0.33±0.06)，N-cadherin、Vimentin蛋白水平[(0.24±0.03)、(0.27±0.03)]低于空載組[(0.40±0.08)、(0.44±0.07)]、空白組[(0.38±0.05)、(0.41±0.10)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

討論

近年來，已從多種惡性腫瘤組織及細胞株中分離出CSCs，并證實了其生物學(xué)性能。研究顯示，結(jié)腸癌中同樣存在腫瘤干細胞[8-10]。本研究利用流式細胞術(shù)從人結(jié)腸癌細胞株中分離出高比例的CD44+/CD133+陽性的CSCs，為下一步研究奠定了基礎(chǔ)。

研究顯示，miRNAs與腫瘤干細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及多向分化密切相關(guān)[11]。miRNAs對結(jié)腸癌干細胞的作用亦有文獻報道[12]。miR-711作為一種抑癌基因，與多種腫瘤細胞的惡性行為有關(guān)，但其對結(jié)腸癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響尚不清楚[13-14]。本研究探討了miR-711對結(jié)腸癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示，過表達miR-711組細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力低于其他兩組，提示miR-711可抑制結(jié)腸癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。miR-711發(fā)揮抑制功能可能與其抑制癌細胞攝取葡萄糖，血管生成及調(diào)控細胞周期蛋白有關(guān)。

EMT是上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，EMT的活化對CSCs的干性、傳代以及腫瘤細胞干性獲得具有重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出具有CSCs特征的結(jié)腸癌細胞球的轉(zhuǎn)移特性與EMT有密切關(guān)系[15]。此外也有報道稱EMT與CSCs在干細胞巢中可以出現(xiàn)轉(zhuǎn)化[16]。上述研究結(jié)果提示CSCs和EMT存在相互作用，兩者共同參與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和治療抵抗過程。腫瘤細胞EMT過程中，細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，極性消失，細胞黏附力下降，從而導(dǎo)致細胞侵襲、遷移能力增強。EMT過程中同時表現(xiàn)為一些分子標記物的改變，如上皮表型標志物E-cadherin下調(diào)，而間質(zhì)表型標志物N-cadherin、Vimentin上調(diào)。任莉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-489可抑制結(jié)腸癌干細胞EMT過程。本研究結(jié)果顯示，過表達miR-711組細胞E-cadherin蛋白表達水平高于空白組及空載組，N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平低于空白組及空載組。提示miR-711過表達可抑制結(jié)腸癌CSCs的EMT過程。

在腫瘤微環(huán)境中，EMT受到大量復(fù)雜的信號通路及相關(guān)影響因子的調(diào)控，如：TGF-β、Wnt、Hedgehog、Notch 信號通路及ZEB1、ZEB2、Twist、Snail、Slug活化因子，這些轉(zhuǎn)錄因子激活后可活化CSCs中的EMT[18-20]。miRNA主要通過靶向一些細胞因子、細胞周期蛋白調(diào)控腫瘤細胞的生物學(xué)行為。本研究結(jié)果顯示，miR-711誘導(dǎo)了腫瘤細胞的EMT過程，但具體機制有待進一步深入的研究。

綜上所述，miR-711的上調(diào)可抑制結(jié)腸癌CSCs的侵襲、遷移及EMT過程。本研究只是初步實驗，有待進一步補充實驗明確下游靶向基因，具體機制也尚需探討。