王亦琳，尹 暉，葉 妮，李 丹，孫 雷，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

環(huán)丙氨嗪(cyromazine, 化學(xué)式C6H10N6)又稱滅蠅胺，是一種高效的三嗪類昆蟲生長抑制劑類殺蟲劑[1]，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。該藥物能有效控制動(dòng)物畜禽舍以及周圍環(huán)境中的有害昆蟲，并促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)性能，因此,該藥在畜牧業(yè)上得到廣泛應(yīng)用。臨床上環(huán)丙氨嗪主要作為預(yù)混劑拌入全價(jià)飼料中，通過飼喂方式進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，大部分以原形及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺(melamine)的形式隨糞便排出體外，并沉積在糞便中以殺滅糞便中的蠅蛆[2]。其作用原理為通過誘使蠅蛆在形態(tài)上發(fā)生畸變，使成蟲羽化不全或受到抑制，從而達(dá)到控制蠅蛆過量繁殖的目的。由于在畜牧生產(chǎn)中濫用環(huán)丙氨嗪，造成動(dòng)物性食品中環(huán)丙胺嗪的殘留，可能通過食物鏈?zhǔn)沟孟M(fèi)者的身體健康受到損害[3-4]。美國國家環(huán)保局(EPA)在1993年將環(huán)丙氨嗪列為具有潛在致癌性的化合物[5]，美國和我國都對(duì)環(huán)丙氨嗪在動(dòng)物性食品中的限量做了嚴(yán)格規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》(GB31650-2019)[6]中，規(guī)定了該藥物在羊的泌乳期禁用，但并未規(guī)定牛奶中環(huán)丙氨嗪的最大殘留限量，參照羊泌乳期禁用情況，一起進(jìn)行牛羊奶中環(huán)丙氨嗪的殘留檢測(cè)技術(shù)研究。目前國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的動(dòng)物性食品中環(huán)丙氨嗪的殘留檢測(cè)分析方法主要有液相色譜法[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因?yàn)榉蛛x能力強(qiáng)，選擇性好，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量成分的分析，并且樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，應(yīng)用最為廣泛。本文擬建立一種液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測(cè)方法。

圖1 環(huán)丙氨嗪化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of cyromazine

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津公司Shimadzu 30A液相色譜儀-美國AB SCIEX公司QTrap 6500質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)； AE260電子天平，Mettler Toledo公司； Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)，賀利氏公司； SIR4渦旋混合器，IKA公司；固相萃取裝置，Waters公司；Organomation Associates氮吹儀，Jnc公司。

1.2 藥品和試劑 環(huán)丙氨嗪對(duì)照品(C6H10N6，CAS：66215-27-8)，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量≥98.0%；環(huán)丙氨嗪同位素對(duì)照品(C313C3H10N6，CAS：1808990-94-4)，含量≥99.4%。甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、乙酸銨(色譜純)，美國Fisher公司；三氯乙酸(分析純)、氨水(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Oasis MCX固相萃取柱：60 mg/3 mL，美國Waters公司；所用水為超純水。

1.3 樣品來源 從北京市超市采購了幾種不同品牌的牛羊奶樣品，選擇無環(huán)丙氨嗪藥物殘留，且基質(zhì)背景較為干凈的樣品作為空白樣品。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取環(huán)丙氨嗪對(duì)照品約10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密稱取環(huán)丙氨嗪-13C標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取1 mg/mL的環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL于100 mL量瓶中，用95%乙腈水溶液溶解并稀釋成濃度為1 μg/mL的環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液；精密量取1 mg/mL的環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液100 μL于100 mL量瓶中，用95%乙腈水溶液溶解并稀釋成濃度為1 μg/mL的環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標(biāo)工作液。

1.5 樣品前處理

1.5.1 樣品的提取 稱取牛奶或羊奶各(2±0.02)g于50 mL離心管內(nèi)，加入適量環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標(biāo)工作液，加入3%三氯乙酸水溶液8 mL，渦旋混合30 s, 超聲提取10 min，靜置10 min，10000 r/min離心10 min，上清液備用。

1.5.2 樣品的凈化與濃縮 MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水溶液各3 mL活化；取備用液全部過柱，用2%甲酸水溶液、甲醇各3 mL淋洗，真空抽干；用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脫，收集洗脫液，于50 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘余物?5%乙腈水溶液1.0 mL充分溶解，取適量體積過微孔濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件 色譜柱為BEH HILIC色譜柱(50 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm)，流動(dòng)相A相為20 mM乙酸銨水溶液；B相為乙腈，梯度洗脫：0～1 min保持95% B；1～3 min，95% B線性變化到60% B；3～3.1 min 60% B線性變化到95% B；3.1～4.5 min保持95% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；電噴霧電壓為5500 V；離子源溫度為550 ℃；輔助氣1為55 psi；輔助氣2為55 psi；氣簾氣為30 psi；碰撞氣為High；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)聯(lián)合信息依賴性采集與增強(qiáng)子離子掃描模式(MRM-IDA-EPI)。環(huán)丙氨嗪定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的去簇電壓、碰撞能量見表1。IDA參數(shù)：①使用動(dòng)態(tài)背景扣除功能；②從不排除之前的目標(biāo)離子；③觸發(fā)閾值：100 cps。EPI參數(shù)：①掃描范圍：m/z70～180；②掃描速度：10000 Da/s；③CE：25 ev；CES：10 ev。

表1 環(huán)丙氨嗪及同位素內(nèi)標(biāo)MRM參數(shù)Tab 1 Mass parameters of cyromazine and its isotopic internal standard

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標(biāo)工作液適量，用95%乙腈水溶液稀釋成含環(huán)丙氨嗪濃度分別為0.5、1、2、5、10和20 ng/mL(含環(huán)丙氨嗪-13C均為2 ng/mL)的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，由低濃度到高濃度依次上機(jī)測(cè)定。以環(huán)丙氨嗪和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標(biāo)的特征離子質(zhì)量色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)，環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.8 方法準(zhǔn)確度及精密度的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶和羊奶中添加定量限、中、高三個(gè)濃度的環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標(biāo)工作液。每種濃度5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，按照1.4項(xiàng)樣品前處理方法處理之后上機(jī)測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，計(jì)算回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.9 方法靈敏度確定 添加適量濃度的環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液于2 g空白牛奶和羊奶中，經(jīng)前處理后測(cè)定，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N) 和對(duì)應(yīng)藥物濃度，以S/N>3(按PtP算)作為方法的檢測(cè)限，以S/N>10作為方法的定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析 在通常的MRM檢測(cè)模式中，通常選擇一個(gè)母離子和兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子進(jìn)行定性分析。但在動(dòng)物源食品的殘留檢測(cè)實(shí)際工作中，由于待測(cè)樣品的基質(zhì)含有蛋白質(zhì)、脂肪以及內(nèi)源性組分等多種干擾物質(zhì)，檢測(cè)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)干擾峰，影響定性和定量的準(zhǔn)確性。本研究采用MRM-IDA-EPI檢測(cè)模式，可以在利用MRM精確定量的同時(shí)，得到目標(biāo)子離子的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖(EPI圖)，通過與對(duì)照溶液的EPI圖進(jìn)行對(duì)比，可以更加準(zhǔn)確地做出定性判斷，排除假陽性。圖2是環(huán)丙氨嗪陽性添加樣品和對(duì)照溶液的EPI圖，可以發(fā)現(xiàn)兩者的特征子離子匹配度很高。按照一個(gè)母離子1個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP)點(diǎn)，一個(gè)子離子1.5個(gè)IP點(diǎn)計(jì)算，圖2中主要有5個(gè)特征子離子，共8.5個(gè)IP點(diǎn)，超出了歐盟2002/657/EC[14]規(guī)定的禁用獸藥，確證檢測(cè)至少有4個(gè)IP點(diǎn)的要求，進(jìn)一步提高了動(dòng)物源食品復(fù)雜基質(zhì)中定性的準(zhǔn)確性。

1—環(huán)丙氨嗪空白牛奶添加樣品；2—環(huán)丙氨嗪對(duì)照溶液1—blank milk sample added with cyromazine；2—standard solution of cyromazine圖2 環(huán)丙氨嗪的EPI圖Fig 2 EPI chromatogram of cyromazine

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以環(huán)丙氨嗪和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標(biāo)的特征離子質(zhì)量色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)，環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)見表2。環(huán)丙氨嗪在0.5～20 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，峰面積之比與濃度呈良好的線性關(guān)系，R2>0.990。

表2 環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab 2 Regression equations and correlation coefficients of cyromazine

2.3 方法靈敏度 按1.9項(xiàng)中所述方法進(jìn)行處理，依據(jù)環(huán)丙氨嗪特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>3和S/N>10分別為方法的檢測(cè)限和定量限，得出在空白牛奶和羊奶中，環(huán)丙氨嗪的檢測(cè)限均為0.2 μg/kg，定量限均為0.5 μg/kg，特征離子質(zhì)量色譜圖見圖3。

1—牛奶；2—羊奶1—milk；2—goat milk圖3 0.5 μg/kg空白牛奶和羊奶添加樣品中環(huán)丙氨嗪藥物特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 3 Characteristic ion mass chromatogram of cyromazine 0.5 μg/kg added in blank milk and goat milk

2.4 方法準(zhǔn)確度及精密度 在空白牛奶和羊奶中各添加3個(gè)不同濃度的環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標(biāo)工作液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果匯總見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)丙氨嗪在牛奶和羊奶0.5～5 μg/kg添加濃度水平上的回收率在98.4%～106%范圍內(nèi)；批內(nèi)RSD在0.795%～2.45%之間，批間RSD在4.86%～5.68%之間。結(jié)果表明本方法定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

表3 空白牛奶和羊奶中環(huán)丙氨嗪添加的回收率(n=5)Tab 3 Recoveries of cyromazine in blank milk and goat milk

3 討論與結(jié)論

目前國內(nèi)外關(guān)于牛羊奶中環(huán)丙氨嗪殘留檢測(cè)的報(bào)道較少[8,10-11]。與現(xiàn)有國內(nèi)外文獻(xiàn)相比, 本研究主要的優(yōu)點(diǎn)是較大幅度地提高了方法定性的準(zhǔn)確性。由于牛奶和羊奶屬于動(dòng)物性樣品，基質(zhì)比較復(fù)雜，在使用通常的MRM方法檢測(cè)時(shí)，尤其是禁用藥物在定量限濃度附近，雜質(zhì)容易干擾目標(biāo)峰。樣品中離子對(duì)豐度比與對(duì)照溶液相比，容許偏差易超出歐盟2002/657/EC[14]中的規(guī)定，對(duì)目標(biāo)物的確證帶來一定的困難。本研究使用的三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀(Qtrap)是以傳統(tǒng)的三重四極桿離子路徑為基礎(chǔ)，第三個(gè)四極桿(Q3)既可以用作三重四極桿，也可以用作線性離子阱，使得儀器同時(shí)具有三重四極桿的準(zhǔn)確定量功能和線性離子阱的高靈敏度定性功能[15-16]。利用該特點(diǎn)，建立了MRM-IDA-EPI的質(zhì)譜分析方法，可以在MRM定量的同時(shí)，獲得高靈敏度的增強(qiáng)子離子掃描的質(zhì)譜圖。在樣品分析時(shí)，儀器首先進(jìn)行探測(cè)掃描，采集化合物的MRM離子對(duì)信息。然后系統(tǒng)自動(dòng)判斷，當(dāng)采集到的MRM信號(hào)強(qiáng)度超過設(shè)定的閾值時(shí)(本研究中設(shè)為100 cps)，系統(tǒng)就會(huì)自動(dòng)切換為線性離子阱模式，進(jìn)行增強(qiáng)子離子掃描(EPI)，獲得相應(yīng)母離子的高質(zhì)量的二級(jí)質(zhì)譜全掃描圖。在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，可將樣品與對(duì)照品或者實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立好的EPI譜庫中的二級(jí)子離子圖進(jìn)行對(duì)比，比較兩者的特征離子的分布及強(qiáng)度，進(jìn)而做出更為準(zhǔn)確地判斷。該方法豐富了樣品定性所需要的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，提高了低濃度水平下目標(biāo)化合物判定的準(zhǔn)確性[17]。

同時(shí)，本文的樣品前處理過程比較簡(jiǎn)單。利用3%三氯乙酸水溶液一步提取待測(cè)組分并沉淀蛋白。針對(duì)環(huán)丙氨嗪為堿性化合物，本研究選用了對(duì)堿性化合物保留較好的MCX固相萃取柱進(jìn)行樣品凈化，獲得了滿意的凈化效果。本文在定量方法選擇時(shí)采用了同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。同位素內(nèi)標(biāo)和分析物的結(jié)構(gòu)相似，和分析物在樣品基質(zhì)中的表現(xiàn)一致，可以有效消除牛羊奶基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高方法定量的準(zhǔn)確性。下一步，本實(shí)驗(yàn)室會(huì)進(jìn)一步研究環(huán)丙氨嗪及類似物在更多動(dòng)物組織中的殘留檢測(cè)方法，擴(kuò)大方法的適用范圍，以便更好的滿足實(shí)際工作的需求。

本文采用液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)建立了一種可檢測(cè)牛奶和羊奶中環(huán)丙氨嗪殘留的分析方法。該方法在進(jìn)行MRM采集的同時(shí)，采用IDA-EPI模式又可以獲得目標(biāo)分析物子離子的完整二級(jí)質(zhì)譜信息，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了定性和定量，可以有效防止假陽性的產(chǎn)生。同時(shí)該方法具有良好的可操作性和重現(xiàn)性，方法靈敏度，準(zhǔn)確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。