范 祺，張 明，張博華，王崇隊，楊立風，孟曉峰，馬 超

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250014）

靈芝孢子油是從靈芝孢子中提取的脂質活性物質，主要化學成分為不飽和脂肪酸、靈芝三萜類、靈芝酸、靈芝多糖、蛋白質、氨基酸等，有抗腫瘤、調節(jié)免疫力、保護神經系統(tǒng)、降血脂、防治白血病、保肝護肝等活性，具有很高的藥用價值[1-2]。雖然靈芝孢子油中不飽和脂肪酸含量高，但在自然環(huán)境下極易被氧化。受光照、溫度、氧氣等因素的影響，靈芝孢子油中的活性物質被氧化后，會產生有害物質，嚴重降低靈芝孢子油的保健功效[3-4]。

乳狀液體系在包埋、保護、運載、成本和生物相容度方面具有獨特的優(yōu)勢[5]，如將不飽和脂肪酸作為油相，既能提高乳狀液的營養(yǎng)價值，也能提高不飽和脂肪酸的抗氧化性[6]。大豆分離蛋白是一種良好的乳化劑，具有親水親油平衡特性，在溶液中可迅速分散在油水界面上，通過結構變化重新排布，形成凝膠化界面層保持乳液穩(wěn)定[7]。大豆分離蛋白制備的乳狀液可以有效包埋DHA、魚油、肉桂精油等[8-10]。大豆異黃酮、茶多酚、抗壞血酸的抗氧化作用可應用于肉制品加工、油脂儲藏及焙烤食品、乳制品、油炸食品的制作，也可用于各種飲料的配制，添加了抗氧化劑的乳狀液具有良好的穩(wěn)定性[11]。

本文利用大豆分離蛋白的乳化特性構建水包油型乳狀液，將靈芝孢子油作為油相包埋在內部，研究大豆分離蛋白和油濃度對乳狀液體系穩(wěn)定性的影響；同時添加大豆異黃酮、茶多酚和抗壞血酸等幾種常用的抗氧化劑，通過儲藏試驗，以過氧化值為指標，研究乳狀液的抗氧化穩(wěn)定性，以期獲得穩(wěn)定性強、抗氧化效果好的大豆分離蛋白-靈芝孢子油乳狀液體系，為靈芝孢子油在食品保健領域的應用及液體口服類產品的開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（純度＞90%），索萊寶試劑公司；靈芝孢子油，淺黃色液體，CO2超臨界萃取所得，購于冠縣合作社；大豆異黃酮、兒茶素、抗壞血酸（純度均≥98%），購于阿拉丁試劑公司；無水乙醇、十二烷基硫酸鈉、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉等試劑，均為分析純，購于上海生工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

AH 2100 型高壓均質機，美國安拓思有限公司；高速剪切乳化均質儀，德國艾卡有限公司；UV1000 紫外-可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；NanoBrook Omni 粒徑分析儀，配備Zeta 電位測量選件，美國布魯克海文儀器公司；ME104 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；BSC-150 恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳狀液的制備

將大豆分離蛋白溶解于水中，室溫下緩慢攪拌1 h使蛋白質充分溶解，將pH 值調至7.0，配制質量分數4%（g/g，下同）的大豆分離蛋白母液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒋蠖狗蛛x蛋白母液與靈芝孢子油按一定比例混合，并加入一定質量的抗氧化劑（大豆異黃酮、茶多酚、抗壞血酸），使體系質量達到100 g。通過高速剪切乳化均質儀以10 000 r/min 的轉速剪切1 min 制成粗乳液，再用高壓均質機在500 bar、4 ℃條件下均質3 次制備乳狀液。

1.3.2 大豆分離蛋白濃度、油濃度對乳狀液性質的影響

油濃度為0.5%，大豆分離蛋白濃度設置為0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%，測定乳狀液的粒徑分布、ζ-電位、離心穩(wěn)定性，考察蛋白濃度對乳狀液的影響。

大豆分離蛋白濃度為0.5%，油濃度設置為0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%，測定乳狀液的粒徑分布、ζ-電位、離心穩(wěn)定性，考察油濃度對乳狀液的影響。所有樣品均進行3 次重復。

1.3.3 乳狀液儲藏過程中的穩(wěn)定性

將制備好的乳狀液（油濃度為0.5%、大豆分離蛋白濃度為0.5%）置于恒溫培養(yǎng)箱中（溫度設置為25 ℃）儲藏10 d，并在第1、2、5、7、10 天測定乳狀液的粒徑、ζ-電位和過氧化值變化。

1.3.4 乳狀液的抗氧化穩(wěn)定性

對照組為靈芝孢子油加入水中，與水混合，最終油濃度為0.5%。將添加了0.1%質量濃度的抗氧化劑的乳狀液和對照組放置于恒溫培養(yǎng)箱中（溫度設置為25 ℃）儲藏10 d，并分別在第1、2、5、7、10 天測定過氧化值。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 粒徑和ζ-電位的測定

采用動態(tài)光散射法（DLS）用于大豆分離蛋白-靈芝孢子油乳狀液的表征。取20 μL 乳狀液樣品，用水溶液稀釋100 倍。在25 ℃條件下，激光衍射角為173°、折射指數為1.450，測定樣品的粒徑分布及ζ-電位。

1.4.2 離心穩(wěn)定性的測定

在2 mL 離心管中準確加入2 mL 乳狀液，800 r/min離心10 min[12]，在距離心管底部1 cm 處取樣30 μL，加入5 mL、0.1%十二烷基硫酸鈉溶液，混勻后在500 nm 下測定吸光度，每個樣品重復測定3 次，結果取平均值。乳狀液穩(wěn)定系數采用式（1）進行計算。

式中，A0為離心前乳狀液的吸光度；At為離心后乳狀液的吸光度。

1.4.3 過氧化值測定

不飽和脂肪酸在空氣中易與氧氣反應而酸敗，氧化過程中活性氧的含量（即過氧化值，用碘的毫克當量表示，單位為mmol/kg）能夠反映油脂和脂肪酸的氧化程度[13]。按《GB 5009.227—2016 食品中過氧化值的測定》測定樣品的過氧化值[14]。

1.5 數據處理

所有數據采用Origin 9.0 軟件繪圖，采用SPSS 19.0處理軟件中T-test 方法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白和油濃度對乳狀液粒徑的影響

2.1.1 蛋白濃度對乳狀液粒徑的影響

不同大豆分離蛋白濃度下的乳狀液粒徑分布如圖1所示。由圖可知，所有的乳狀液呈現(xiàn)雙峰分布，第一個峰代表的是乳狀液中游離蛋白的粒徑，第二個峰為乳狀液顆粒分布[15]。當大豆分離蛋白濃度為0.1%時，乳狀液的兩個峰分別在272 nm 和2 080 nm 處；當大豆分離蛋白濃度增加時，乳狀液粒徑變小，說明乳狀液穩(wěn)定性有所改善。如大豆分離蛋白濃度為0.2%時，乳狀液兩個峰分別為200 nm 和800 nm；當大豆分離蛋白濃度為0.5%時，乳狀液的粒徑達到最小值，分別為160 nm 和695 nm。繼續(xù)增大大豆分離蛋白濃度，乳狀液的粒徑變大，這可能是因為大豆分離蛋白在水中的溶解度有限，濃度過高，蛋白之間相互聚集，導致乳狀液粒徑變大。

圖1 不同蛋白濃度下乳狀液的粒徑分布Fig.1 Size distribution of emulsions with different protein concentrations

2.1.2 油濃度對乳狀液粒徑的影響

不同油濃度條件下的乳狀液粒徑分布如圖2（見下頁）所示。由圖可知，所有的乳狀液均呈現(xiàn)雙峰分布，隨著油濃度的增加，乳狀液粒徑逐漸增大；當油濃度為0.1%時，粒徑最小，兩個峰分別為120 nm 和600 nm。油濃度為0.2%、0.5%和1.0%時，乳狀液粒徑小幅增加。當乳狀液中油濃度為2.0%時，乳狀液粒徑分布明顯變大，說明油濃度增加，大豆分離蛋白的包埋能力有限，顆粒之間容易發(fā)生絮集，導致粒徑變大。

圖2 不同油濃度條件下乳狀液的粒徑分布Fig.2 Size distribution of emulsions with different oil concentrations

2.2 蛋白和油濃度對乳狀液ζ-電位的影響

ζ-電位是用來表征乳狀液穩(wěn)定性的重要指標。大豆分離蛋白的等電點為4.5～4.6，所有乳狀液的電位在pH為7 的條件下都是負值[16]。在圖3 中，0.1%大豆分離蛋白的乳狀液電位絕對值為32.15 mV，隨著蛋白濃度的進一步提高，電位一直增大。大豆蛋白濃度超過1.0%之后，ζ-電位絕對值下降明顯。當蛋白濃度為2.0%時，為59.29mV。

圖3 不同蛋白濃度下乳狀液的ζ-電位Fig.3 ζ-potential of emulsions with different protein concentrations

圖4 為不同油濃度下乳狀液的ζ-電位，當油濃度為0.1%時，ζ-電位絕對值為75.15 mV。當油濃度提高到1%時，乳狀液的ζ-電位絕對值明顯變小，為48.2 mV；當油濃度為2.0%時，ζ-電位絕對值進一步下降。當粒子的ζ-電位絕對值大于30 mV 時，通常被認為是穩(wěn)定的[17]。在乳狀液中存在空間排阻效應，粒子的ζ-電位絕對值大于20 mV 時，也可能使粒子穩(wěn)定分散于溶液中，當油濃度過高時，乳狀液乳化能力有限，不能阻止粒子之間的聚集[18]。

圖4 不同油濃度下乳狀液的ζ-電位Fig.4 ζ-potential of emulsions with different oil concentrations

2.3 大豆分離蛋白和油濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響

2.3.1 大豆分離蛋白濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響

圖5 為大豆分離蛋白濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響。由圖可以看出，隨著大豆分離蛋白濃度的升高，離心穩(wěn)定系數先增大后減少，當蛋白濃度為1.0%時，離心穩(wěn)定系數最大，為88%，表明此時的乳狀液最穩(wěn)定。當大豆蛋白濃度為2.0%時，乳狀液的離心穩(wěn)定系數下降為76%。根據斯托克斯定律，提高分層穩(wěn)定性可以通過減小液滴粒徑、升高連續(xù)相黏度或者減小液滴和連續(xù)相之間的密度差來達到。按照這個定律分析乳狀液穩(wěn)定性的變化趨勢，大豆分離蛋白濃度在0.1%～1.0%時，乳狀液穩(wěn)定性逐步上升，分析原因是連續(xù)相中未吸附的粒子的存在形成了粒子和液滴之間的三維網絡結構，升高了連續(xù)相的黏度，減緩了液滴的遷移；另一方面大豆分離蛋白包覆在油滴表面增加了油滴的密度，減小了油滴和連續(xù)相的密度差；之后，由于大豆蛋白在界面及液相中的相互纏結，促進了液滴之間的絮凝，從而導致過高濃度的大豆蛋白降低了乳液的分層穩(wěn)定性[19-20]。

圖5 大豆分離蛋白濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of soybean protein isolate concentration on centrifugal stability of emulsions

2.3.2 油濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響

圖6 為油濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響，可以看出隨著油濃度的提升，靈芝孢子油乳狀液離心穩(wěn)定性不斷下降，由90%逐步下降為27%，這是由于油濃度過高，而大豆蛋白的乳化能力有限，不能形成足夠多的乳狀液顆粒，不能減小油滴和連續(xù)相的密度差，從而導致乳狀液不穩(wěn)定[21]。根據上述結果，選擇0.5%濃度的大豆分離蛋白和0.5%靈芝孢子油含量來制備乳狀液比較合適。

圖6 不同油濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of different oil concentrations on the centrifugal stability of emulsions

2.4 乳狀液的儲藏穩(wěn)定性

2.4.1 儲藏過程中乳狀液粒徑的變化

圖7 為0.5%大豆分離蛋白-0.5%靈芝孢子油乳狀液儲藏10 d 內的粒徑變化圖。由圖可知，乳狀液粒徑在前2d 變化不明顯，在第2 天時，乳狀液粒徑峰位于150 nm和700 nm 左右。當儲藏至第5 天時，粒徑出現(xiàn)明顯的增大，兩個峰分別位于190 nm 和1 400 nm 處。第7 天，乳狀液粒徑又進一步增大。第10 天時乳狀液粒徑幾乎只剩下一個單峰，位于2 500 nm 處左右，此時乳狀液出現(xiàn)了大顆粒聚集。

圖7 乳狀液儲藏過程中的粒徑變化Fig.7 Size distribution of emulsions during storage

2.4.2 儲藏過程中乳狀液電位的變化

圖8 為0.5%大豆分離蛋白-0.5%靈芝孢子油乳狀液儲藏10 d 內的ζ-電位變化圖。由圖可以看出，乳狀液在儲藏2d 后ζ-電位變化不明顯，第2 天絕對值為58.46 mV。儲藏至第5 天時，乳狀液的ζ-電位絕對值明顯變小，為36.71 mV。儲存至第10 天時，ζ-電位的絕對值最小，為10.29 mV。乳狀液的絕對值小于20 mV，說明此時的乳狀液已經不穩(wěn)定。

圖8 乳狀液儲藏過程中ζ-電位變化Fig.8 ζ-potential of emulsions during storage

2.5 乳狀液的氧化穩(wěn)定性

圖9（見下頁）為儲藏過程中乳狀液的氧化穩(wěn)定性，為0.5%大豆蛋白與0.5%靈芝孢子油經均質制備而成的乳狀液，并在其中加入了不同種類的抗氧化劑。在第1 天時，所有乳狀液的過氧化值基本接近，其中對照組的過氧化值最大，為0.45 mmol/kg。儲藏至第2 天時，對照組的過氧化值明顯增大，為2.25 mmol/kg，其次為乳狀液（0.98 mmol/kg）。而加入抗氧化劑保護的乳狀液，過氧化值變化不明顯。儲藏至第5 天時，差距進一步拉大，加入抗氧化劑的保護優(yōu)勢凸顯出來，三者差距不大，對照組為3.76 mmol/kg，乳狀液的過氧化值之間為2.75 mmol/kg。儲藏至第7 天時，對照組與乳狀液的差距明顯，茶多酚和抗壞血酸具有良好的保護效果，相比對照組的7.77 mmol/kg，僅為1.2 mmol/kg。儲藏到第10 天時，過氧化值大小順序為對照＞乳狀液＞大豆異黃酮＞抗壞血酸＞茶多酚，過氧化值分別為10.12、7.15、4.04、2.88、1.88 mmol/kg。與對照組相比，乳狀液的過氧化值降低了29.24%，加入了茶多酚的乳狀液則降低了81.42%。說明乳狀液對靈芝孢子油具有良好的保護效果，加入抗氧化劑后，保護效果進一步增強，其中茶多酚的效果最好。

圖9 乳狀液儲藏過程中過氧化值變化Fig.9 Peroxide values of emulsions during storage

3 結論

本文利用大豆分離蛋白的乳化特性構建水包油型乳狀液，將靈芝孢子油作為油相包埋在內部，通過研究蛋白和油濃度對乳狀液體系穩(wěn)定性的影響，構建最佳的乳狀液包埋體系。制備的乳狀液均呈現(xiàn)雙峰分布。當蛋白濃度為0.1%～0.5%時，隨著蛋白濃度的增加，乳狀液粒徑分布變小，說明乳狀液穩(wěn)定性有所改善。制備的乳狀液的ζ-電位絕對值均大于20 mV。隨著大豆蛋白濃度的升高，乳狀液離心穩(wěn)定系數增大，由最低的25%提升到88%，當蛋白濃度為1.0%時，離心穩(wěn)定系數最大，表明此時的乳狀液最穩(wěn)定。隨著油濃度的提升，靈芝孢子油乳狀液離心穩(wěn)定性在不斷下降。當油濃度為1.0%時，乳狀液離心穩(wěn)定系數很低。綜合粒徑和電位數據，當蛋白濃度為0.5%和油濃度為0.5%時，能制得穩(wěn)定性較好的乳狀液。當儲藏至第5 天，粒徑出現(xiàn)明顯的增大，ζ-電位絕對值變小。儲藏到第10 天時，過氧化值從大到小的順序分別為對照＞乳狀液＞大豆異黃酮＞抗壞血酸＞茶多酚。表明大豆分離蛋白制備的乳狀液可以有效包埋靈芝孢子油，并能有效增強靈芝孢子油的氧化穩(wěn)定性。本文為靈芝孢子油在食品保健領域的應用以及液體口服類產品的開發(fā)提供理論支持。