曾丹琦, 張明澤, 何春梅, 王浩斌, 俞振明, 司燦, 趙聰慧,李冬妹, 段俊*

鐵皮石斛WOX轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和分析

曾丹琦1,2, 張明澤1,2, 何春梅1, 王浩斌1,2, 俞振明1, 司燦1,2, 趙聰慧1,2,李冬妹3, 段俊1*

(1. 中國科學院華南植物園，廣東省應(yīng)用植物學重點實驗室，中國科學院華南農(nóng)業(yè)植物分子分析與遺傳改良重點實驗室，廣州 510650；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 順德職業(yè)技術(shù)學院，廣東 佛山 528300)

為了解鐵皮石斛() WOX轉(zhuǎn)錄因子的功能，采用全基因組分析技術(shù)對鐵皮石斛WOX家族成員進行鑒定，并進行生物信息學和表達模式分析。結(jié)果表明，鐵皮石斛基因組中有9個WOX轉(zhuǎn)錄因子(DoWOX 1DoWOX 9)，大部分的含有2～3個外顯子，啟動子含有與激素誘導(dǎo)、逆境脅迫和生長發(fā)育有關(guān)的順式作用元件。qPCR分析表明，、、、和在類原球莖中的表達量最高，在小花蕾中表達最高, 隨著花的發(fā)育，表達呈現(xiàn)下降趨勢。此外，、和在合蕊柱上的表達量最高，而在唇瓣的表達量最高。因此，可能參與調(diào)控鐵皮石斛的生長發(fā)育，且可能在維持類原球莖狀態(tài)和花的發(fā)育中起重要作用。

鐵皮石斛；WOX轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學；基因表達；qPCR

植物展示出非凡的再生能力，保證發(fā)育的可塑性。植物干細胞是未分化的細胞，位于分生組織, 未分化的狀態(tài)為穩(wěn)定的遺傳性、較高的線粒體活性以及很強的分化和自我更新能力等奠定了基礎(chǔ)[1-2]，進而對環(huán)境變化信號快速響應(yīng)和對植物發(fā)育進程參與調(diào)控[3]。植物細胞全能性在生物技術(shù)上具有廣泛的應(yīng)用市場。目前對于植物的干細胞研究主要在擬南芥()等的莖尖干細胞[4-5]、水稻()等的根尖干細胞[6]上，植物干細胞發(fā)生機理在種苗生產(chǎn)、生物技術(shù)等領(lǐng)域扮演舉足輕重的角色。

WOX家族(WUSCHEL-related homeobox)是真核細胞homeobox (HB)超家族中的一員[7-8]。WOX轉(zhuǎn)錄因子具有“螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”的典型結(jié)構(gòu)[8-9]，在植物發(fā)育過程中扮演重要的調(diào)控角色[10-11]，包括在植物干細胞維持、胚胎形成及莖干、根和花的發(fā)育等。有研究表明，在根和莖分生組織中干細胞生態(tài)位的發(fā)育上具有重要作用[11-12]；植物的胚胎發(fā)育是個復(fù)雜的過程，不僅受到運輸調(diào)控, 而且受到局部生長素反應(yīng)的影響[13]，可以決定植物胚胎發(fā)育的細胞命運[12]；在根發(fā)育中,在不定根基源細胞中表達[12,14]以激活LBD16，進而保證根的正常發(fā)育；在形成層干細胞中，和其余WUS成員在干細胞維持中起重要作用[15-16]; WOX轉(zhuǎn)錄因子在花的結(jié)構(gòu)和發(fā)育上具有重要的調(diào)控作用[17]，被認為是花干細胞維持必需的基因[17-18],在矮牽牛()和煙草()中是保證花器官結(jié)構(gòu)正常的必需基因[19-20]。WUS家族蛋白成員可以分為3個進化支: 分別為WUS、Ancient和Intermediate[8]，但對其功能還不清楚。

鐵皮石斛()為蘭科(Orchi- daceae)石斛屬草本植物，有較高的藥用價值, 具有抗腫瘤、增加免疫力和益胃生津等功效[21-22]。由于對過度采挖導(dǎo)致野生資源大量減少，因此從分子水平研究鐵皮石斛的生長發(fā)育對保護其資源具有重大意義。目前關(guān)于WOX轉(zhuǎn)錄因子的功能研究主要在模式植物擬南芥和水稻上，對中藥材如鐵皮石斛[23-24]的相關(guān)研究鮮見報道。此外，蘭科植物的花在結(jié)構(gòu)上高度特化，如具有形態(tài)特異的萼片、唇瓣和合蕊柱[25]。本研究根據(jù)已報道的鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)[26]，對其WOX家族進行鑒定和生物信息學分析，并分析基因在不同生長發(fā)育階段和花的不同組織中的表達模式，為探討WOX轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控鐵皮石斛生長發(fā)育中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

鐵皮石斛()種植于中國科學院華南植物園苗圃。取約1 cm長的花蕾，分別收集萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱，液氮速凍15 min，保存于-80℃冰箱備用。

鐵皮石斛組培苗在1/2MS+0.1%活性炭+2%蔗糖+0.6%瓊脂培養(yǎng)基(pH 5.4)上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為(26±1)℃、32.57mol/(m2·s)、12 h光照/12 h黑暗, 相對濕度約為60%。采集的類原球莖、叢生芽(無根)和小苗(約3 cm高)經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定和序列分析

從NCBI (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov)基因組數(shù)據(jù)庫下載鐵皮石斛基因組文件，利用Pfam、Swiss_Prot、eggNOG_class、NR注釋結(jié)果檢索WOX轉(zhuǎn)錄因子。然后對檢索到的WOX蛋白序列與擬南芥WOX蛋白序列進行比對，并構(gòu)建進化樹，刪除同源性低且遺傳距離較遠，剩余基因即為鐵皮石斛。

1.3 多重序列比對和進化樹分析

采用DNAMAN8軟件對鐵皮石斛WOX家族成員的氨基酸序列進行比對。采用Clastal X version 2.0軟件對鐵皮石斛的WOX蛋白進行比對，輸出Fasta格式文件，導(dǎo)入MEGA，利用鄰接法(Neighbor- Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)，進行1 000次重復(fù)bootstrap統(tǒng)計學檢測。

1.4 WOX的生物信息學分析

從鐵皮石斛全基因組測序GFF文件中獲得的GFF注釋，利用GSDS在線軟件(http://gsds. cbi.pku.edu.cn/)繪制鐵皮石斛WOX家族成員的基因結(jié)構(gòu)。利用在線工具MEME (http://alternate.meme- suite.org/tools/meme)搜索鐵皮石斛WOX基因家族成員的motif，用PlantCare在線軟件(http://bioinfor-matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測啟動子中的順式作用元件，并用TBtools制圖。

1.5 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

參照柱式植物RNAOut 2.0試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)說明書，分別提取鐵皮石斛不同發(fā)育時期(類原球莖、叢生芽和小苗)和花的不同組織(萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱)的總RNA。提取的RNA經(jīng)DNA酶消化后，取2L進行電泳檢測，再采用Promega公司的GoScript? Reverse Transcription System試劑盒，取4g已純化的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20L。

1.6 表達分析

采用美國BIO-RAD公司iTaq Universl SYBR Green supermix反應(yīng)試劑對9個進行實時熒光定量PCR (qPCR)分析。使用Primer Premier 5.0軟件在基因特異性區(qū)域設(shè)計引物(表1)，以鐵皮石斛為內(nèi)參基因(NCBI accession No.: JX294908), 于ABI 7500 Real-time PCR儀上進行qPCR，并使用其系統(tǒng)軟件對數(shù)據(jù)進行處理, 采用2?ΔΔCT方法[27]計算相對表達量。鐵皮石斛花的發(fā)育分為3個時期：小花蕾期(約0.5 cm)、中花蕾期(約1 cm)和全開期。采用qPCR對在花不同發(fā)育階段和不同組織的表達模式進行分析。用百邁客云平臺(http://www. biocloud.net/)在線軟件繪制熱圖(heatmap)。

表1 實時熒光定量PCR所用引物

2 結(jié)果和分析

2.1 WOX轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和進化樹構(gòu)建

在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫下載鐵皮石斛基因組文件，并利用Pfam、Swiss_Prot、eggNOG_class、NR注釋結(jié)果檢索WOX轉(zhuǎn)錄因子，共鑒定出9個鐵皮石斛WOX家族基因成員，分別命名為、、、、、、、和。

以鐵皮石斛WOX家族蛋白和擬南芥WOX家族蛋白構(gòu)建進化樹(圖1)，結(jié)果表明, 鐵皮石斛的WOX家族可分成3個進化支，分別為WUS、Ancient和Intermediate，其中WUS的成員數(shù)量最多，分別是DoWOX3、DoWOX4、DoWOX5、DoWOX6和DoWOX9；其次是Intermediate，分別是DoWOX1、DoWOX2和DoWOX7；Ancient的數(shù)量最少，僅有DoWOX8。此外，WUS支的DoWOX4和DoWOX5的分支長度差比其他DoWOXs間的分支長度差短、置信度最高，說明DoWOX4和DoWOX5親緣關(guān)系最近、同源性最高，暗示他們具有相似的功能。

2.2 DoWOXs的生物信息學分析

使用DNAMAN的默認參數(shù)對9個DoWOXs進行多重序列比對，結(jié)果表明，鐵皮石斛WOX家族成員均含有保守的同源異型結(jié)構(gòu)域(homeobox domain, HD)，具有“螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”的結(jié)構(gòu)特征(圖2)。此外，在螺旋I和螺旋III中存在許多高度保守的位點，暗示這些氨基酸殘基可能在基因功能上發(fā)揮重要的作用。

利用MEME工具對鐵皮石斛WOX家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)進行分析(圖3), 結(jié)果表明，所有DoWOXs都含有串聯(lián)的Motif1和Motif2，說明其在WOX家族成員中較為保守。在Intermediate成員中存在Motif3的保守基序；WUS家族成員中除DoWOX9外，其余成員在C端都有保守的Motif4；Ancient成員DoWOX8含有的保守基序最少，說明WOX可能具有復(fù)雜的進化過程。此外，同一亞家族中的DoWOX4和DoWOX5的保守基序都是5個，且位置相近，表現(xiàn)了很強的一致性，說明DoWOX4和DoWOX5具有相似的蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)，同時從側(cè)面反映了系統(tǒng)進化樹分析的可靠性。

圖1 鐵皮石斛(Do)和擬南芥(At)的WOX家族成員構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

圖2 鐵皮石斛WOX家族成員氨基酸序列的多重比對

2.3 DoWOXs基因結(jié)構(gòu)

利用在線軟件GSDS構(gòu)建鐵皮石斛基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖(圖4)，可見，大部分有內(nèi)含子1～3個，外顯子1～3個。結(jié)合系統(tǒng)進化樹，不同進化分支的基因結(jié)構(gòu)差異明顯, 即使是相同分支的基因間也存在一定差異，但同源性最高的和的基因結(jié)構(gòu)極其相似。此外，同為WUS支的，其基因結(jié)構(gòu)與和相似，皆為2個外顯子，1個內(nèi)含子，說明WUS支的基因結(jié)構(gòu)較為保守。Ancient支中的有3個外顯子和2個內(nèi)含子。

圖3 DoWOXs蛋白的保守基序

對的啟動子用PlantCARE進行分析(圖5)，結(jié)果表明，9個共含有13個與生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，不同基因間的順式作用元件不同。其中，順式作用元件meristem expre- ssion共有6個，含有3個，說明其可能在鐵皮石斛分生組織的生長上扮演重要角色。與激素相關(guān)的順式作用元件有auxin-responsive、gibbe- rellin-responsive、MeJA-responsive、abscisic acid responsive、salicylic acid responsive等，在植物和環(huán)境脅迫的適應(yīng)中扮演重要角色；與逆境脅迫相關(guān)的非生物激素的順式作用元件有drought-inducibility、defense and stress responsive、low-temperature responsive和anaerobic induction等，間接影響生長發(fā)育。這說明WOX家族成員在鐵皮石斛生長發(fā)育過程中，參與胚胎發(fā)育、種子萌發(fā)、分生組織生長、根系發(fā)育和環(huán)境脅迫的調(diào)控等活動。

2.4 DoWOXs的表達

鐵皮石斛類原球莖被認為是體胚[28]，可增殖, 亦可分化成完整的植株，而WOX成員在維持植物的干細胞狀態(tài)中起著重要的作用。采用qPCR技術(shù)分析了在鐵皮石斛不同發(fā)育階段中的表達模式(圖6)，結(jié)果表明，除外其余在類原球莖、叢生芽和小苗中有表達。、、、和在類原球莖中的表達量最高，表明WOX在鐵皮石斛的類原球莖發(fā)育中扮演重要角色。在叢生芽中的表達量最高，在小苗中最高,和在3個不同發(fā)育時期表達量均較高。此外，不同發(fā)育時期優(yōu)勢表達的不同，如在類原球莖特異表達，可能與其具有不同的啟動子順式作用元件有關(guān)。

圖4 DoWOXs基因結(jié)構(gòu)

圖5 DoWOXs啟動子中的順式作用元件

圖6 DoWOXs基因在鐵皮石斛不同發(fā)育時期的表達

開花是植物發(fā)育中非常重要的階段，WOX參與植物花發(fā)育過程[18]。利用本實驗室建立的鐵皮石斛花發(fā)育數(shù)據(jù)庫，獲取了在小花蕾(S1)、中花蕾(S2)和全開花(S3)中的表達數(shù)據(jù)，利用百邁客云平臺在線軟件繪制熱圖(圖7)，可見，、的表達模式較為相似，在S1時期的表達量最高，其次為S2時期，S3時期最低，暗示這2個基因在花發(fā)育過程中功能相似。在3個時期的FPKM值均大于20，S2時期的表達量最高，而其他在3個時期的FPKM均小于5。

圖7 DoWOXs在鐵皮石斛不同開花期的表達譜。S1: 小花蕾; S2: 中花蕾; S3: 全開花; 紅色: 上調(diào); 綠色: 下調(diào)。

蘭科植物的花具有較高的觀賞價值主要源于其獨特的花型，有3個瓣化的萼片，2個花瓣，1個唇瓣和1個合蕊柱[29]。進一步選取S2時期的花蕾進行不同組織的表達分析，結(jié)果表明(圖8),和在花蕾的4個組織中均未表達；僅在唇瓣和合蕊柱中表達；其余6個在中花蕾的不同組織中均有表達，其中在唇瓣中表達較高，在萼片中表達最高，在花瓣中表達最高，和在合蕊柱中表達最高。這暗示家族成員在鐵皮石斛花生長發(fā)育過程中具有不同的調(diào)控作用。此外,和在合蕊柱的表達量遠高于其他花器官，可能與花形態(tài)發(fā)育密切相關(guān)。

3 結(jié)論和討論

參與調(diào)控植物發(fā)育的基因在形態(tài)建成中起著關(guān)鍵的作用。WOX轉(zhuǎn)錄因子是參與植物發(fā)育的重要家族之一。本研究從鐵皮石斛全基因組中鑒定出9個WOX轉(zhuǎn)錄因子(DoWOX1～DoWOX9)，生物信息學和表達分析表明，WOX轉(zhuǎn)錄因子在鐵皮石斛的生長發(fā)育尤其是類原球莖和花發(fā)育中起重要的調(diào)控作用。和在開花時期表達量的變化規(guī)律一致，且DoWOX4和DoWOX5氨基酸序列相似度高(圖1)，暗示這2個轉(zhuǎn)錄因子可能在調(diào)控花發(fā)育過程中的功能相似。此外，DoWOX4、DoWOX5和AtWOX3在系統(tǒng)進化樹上的親緣關(guān)系最近，AtWOX3在擬南芥花發(fā)育尤其是花表型構(gòu)成中起作用[18]。

9個編碼蛋白的同源異型結(jié)構(gòu)域(HD)保守性高，具有典型的“螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”結(jié)構(gòu)，這與其他物種[30-31]的研究結(jié)果一致，表明該同源異型結(jié)構(gòu)域在進化上具有較高的保守性。該同源異型結(jié)構(gòu)域可以特異地和DNA序列結(jié)合而發(fā)揮重要的作用[32]，如作為HOX蛋白的輔助因子影響植物、動物和真菌的發(fā)育[8]?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明, WUS支的成員基因結(jié)構(gòu)較為保守。不同支系DoWOXs蛋白的保守基序在數(shù)量、位置上具有較高的相似性，這與系統(tǒng)進化樹的結(jié)果一致。此外，Motif1和Motif2基序的保守程度更高。

基因的表達調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合基因的順式作用元件來調(diào)控基因的表達。的啟動子上含有響應(yīng)植物激素和逆境脅迫等相關(guān)的順式作用元件，生長素可調(diào)控胚胎發(fā)育[33]、脫落酸影響種子休眠和萌發(fā)[34]，茉莉酸甲酯(MeJA)參與植物防御反應(yīng)[35]，因此，可能參與植物生長發(fā)育和防御反應(yīng)。

類原球莖、芽和小苗是鐵皮石斛3個典型的生長發(fā)育階段。5個在類原球莖中高表達, 說明在調(diào)控鐵皮石斛類原球莖發(fā)育具有重要的作用，這與梁易等[24]的研究結(jié)果一致。類原球莖發(fā)育是鐵皮石斛的特有階段。在類原球莖中表達量最高，在芽和小苗中不表達，與同源性最高的的表達模式相似[36]。有大量研究表明，在植物的胚胎發(fā)育中扮演不同的角色，如

和影響擬南芥的胚胎模式[12]，調(diào)控云杉()的體細胞胚胎發(fā)生[37]。在芽中表達最高，可能與鐵皮石斛芽發(fā)育有關(guān)。參與調(diào)控植物芽的發(fā)育，如在擬南芥芽再生發(fā)育過程是必需的[38]、通過招募相關(guān)蛋白影響水稻芽的發(fā)育[39]。除外，其余在小苗中均有表達，說明可能調(diào)控鐵皮石斛小苗發(fā)育?；òl(fā)育是植物生殖階段的重要過程，在小花蕾、中花蕾和全開花時期都有表達，說明在鐵皮石斛花發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。調(diào)控花發(fā)育的作用在擬南芥、矮牽牛和煙草等植物中已有報道[17-20]。除和外，其余均在中花蕾不同組織中表達，說明在中花蕾時期和可能和其他存在功能冗余的情況，具體功能還需進一步研究。合蕊柱是蘭科植物花的獨特結(jié)構(gòu)，和在合蕊柱中的表達量遠遠高于其他組織，推測兩者調(diào)控鐵皮石斛花的發(fā)育，但具體功能有待進一步研究。同一亞家族成員存在一些相似的功能，有研究表明WUS分支的其他成員存在不同程度替代WUS在芽和花干細胞維持方面的功能[16]，這為尋找WOX家族的共性提供一個突破口。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是目前解決鐵皮石斛種苗較難繁殖的主要方式，干細胞的形成與分化是組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)，因此，研究鐵皮石斛干細胞的相關(guān)分子機理具有十分重要的意義。蘭科植物的花是重要的生殖器官，而且具有較高的觀賞價值，研究蘭科植物花器官發(fā)育對了解其花形成機制及品種選育提供了重要的理論基礎(chǔ)。本研究為進一步挖掘鐵皮石斛WOX轉(zhuǎn)錄因子功能奠定了基礎(chǔ)。

[1] SCHERES B. Stem-cell niches: Nursery rhymes across kingdoms [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(5): 345-354. doi: 10.1038/nrm2164.

[2] LAUX T. The stem cell concept in plants: A matter of debate [J]. Cell, 2003, 113(3): 281-283. doi: 10.1016/s0092-8674(03)00312-x.

[3] LUO L J, ZENG J, TIAN Z X, et al. Plant development: From cells to individuals [J]. Chin Sci Bull, 2016, 61(33): 3532-3540. doi: 10.1360/ N972016-00906.羅林杰, 曾健, 田朝霞, 等. 植物的發(fā)育: 從細胞到個體[J]. 科學通報, 2016, 61(33): 3532-3540. doi: 10.1360/N972016-00906.

[4] SANG Y L, CHENG Z J, ZHANG X S. Plant stem cells andorganogenesis [J]. New Phytol, 2018, 218(4): 1334-1339. doi: 10.1111/ nph.15106.

[5] SCHOOF H, LENHARD M, HAECKER A, et al. The stem cell popu- lation ofshoot meristems is maintained by a regulatory loop between theandgenes [J]. Cell, 2000, 100(6): 635-644. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80700-X.

[6] YU Y M, LEE E K, HONG S M, et al. Plant stem cell line derived from quiescent center and method for isolating the same: EP, 20080832681 [P]. 2010-05-26.

[7] GEHRING W J. Homeo boxes in the study of development [J]. Science, 1987, 236(4806): 1245-1252. doi: 10.1126/science.2884726.

[8] VAN DER GRAAFF E, LAUX T, RENSING S A. The WUS homeobox- containing (WOX) protein family [J]. Genome Biol, 2009, 10(12): 248. doi: 10.1186/gb-2009-10-12-248.

[9] LIAN G B, DING Z W, WANG Q, et al. Origins and evolution of WUSCHEL-related Homeobox protein family in plant kingdom [J]. Sci World J, 2014, 2014: 534140. doi: 10.1155/2014/534140.

[10] MUKHERJEE K, BROCCHIERI L, BüRGLIN T R. A comprehensive classification and evolutionary analysis of plant Homeobox genes [J]. Mol Biol Evol, 2009, 26(12): 2775-2794. doi: 10.1093/molbev/msp201.

[11] SARKAR A K, LUIJTEN M, MIYASHIMA S, et al. Conserved factors regulate signalling inshoot and root stem cell organizers [J]. Nature, 2007, 446(7137): 811-814. doi:10.1038/nature 05703.

[12] HAECKER A, GRO?-HARDT R, GEIGES B, et al. Expression dyna- mics ofgenes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in[J]. Development, 2004, 131(3): 657-668. doi:10.1242/dev.00963.

[13] HAMANN T, BENKOVA E, B?URLE I, et al. Thegene encodes an auxin response protein inhibiting MONOPTEROS-mediated embryo patterning [J]. Genes Dev, 2002, 16(13): 1610-1615. doi:10.1101/gad.229402.

[14] SHENG L H, HU X M, DU Y J, et al. Non-canonical-mediated root branching contributes to plasticity inroot system architecture [J]. Development, 2017, 144(17): 3126-3133. doi:10.1242/ dev.152132.

[15] SUER S, AGUSTI J, SANCHEZ P, et al.imparts auxin respon- siveness to cambium cells in[J]. Plant Cell, 2011, 23(9): 3247-3259. doi:10.1105/tpc.111.087874.

[16] DOLZBLASZ A, NARDMANN J, CLERICI E, et al. Stem cell regu- lation bygenes [J]. Mol Plant, 2016, 9(7): 1028- 1039. doi:10.1016/j.molp.2016.04.007.

[17] LAUX T, MAYER K F X, BERGER J, et al. Thegene is required for shoot and floral meristem integrity in[J]. Development, 1996, 122(1): 87-96.

[18] COSTANZO E, TREHIN C, VANDENBUSSCHE M. The role ofgenes in flower development [J]. Ann Bot, 2014, 114(7): 1545- 1553. doi:10.1093/aob/mcu123.

[19]VANDENBUSSCHE M, HORSTMAN A, ZETHOF J, et alDifferential recruitment oftranscription factors for lateral development and organ fusion in petunia and[J]. Plant Cell, 2009, 21(8): 2269-2283. doi: 10.1105/tpc.109.065862.

[20] MCHALE N A, MARCOTRIGIANO M.is required for dorso- ventrality and lateral growth of the leaf blade in[J]. Development, 1998, 125(21): 4235-4243.

[21] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, Vol. 2 [M]. Beijing: China Medical Science Press, 2015: 282-283.國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典, 第2部 [M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 282-283.

[22] ZHANG M Z, HE C M, WANG H B, et al. Advances in active polysaccharides in medicinal plants of Orchidaceae [J]. J Trop Subtrop Bot, 2019, 27(5): 611-622. doi: 10.11926/jtsb.4073.張明澤, 何春梅, 王浩斌, 等. 蘭科藥用植物活性多糖研究進展 [J]. 熱帶亞熱帶植物學報, 2019, 27(5): 611-622. doi: 10.11926/jtsb.4073.

[23] RAMKUMAR T R, KANCHAN M, UPADHYAY S K, et al. Identification and characterization of WUSCHEL-related homeobox() gene family in economically important orchid speciesand[J]. Plant Gene, 2018, 14: 37-45. doi:10.1016/j.plgene.2018.04.004.

[24] LIANG Y. Expression analysis ofandinduring protocorm development[D]. Chengdu: Southwest Jiaotong University, 2018: 1-61.梁易. 鐵皮石斛原球莖發(fā)育過程中與的表達分析 [D]. 成都: 西南交通大學, 2018: 1-61.

[25] XIANG L, LI B J, QIN D H, et al. Advances in molecular biology of orchid floral development [J]. Chin J Cell Biol, 2011, 33(5): 554-563.向林, 李伯鈞, 秦德輝, 等. 蘭花花發(fā)育的分子生物學研究進展 [J]. 中國細胞生物學學報, 2011, 33(5): 554-563.

[26] ZHANG G Q, LIU K W, LI Z, et al. Thegenome and the evolution of orchids [J]. Nature, 2017, 549(7672): 379-383. doi:10. 1038/nature23897.

[27] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408. doi:10.1006/meth.2001.1262.

[28] LEE Y I, HSU S T, YEUNG E C. Orchid protocorm-like bodies are somatic embryos [J]. Amer J Bot, 2013, 100(11): 2121-2131. doi:10. 3732/ajb.1300193.

[29] RUDALL P J, BATEMAN R M. Roles of synorganisation, zygo- morphy and heterotopy in floral evolution: The gynostemium and labellum of orchids and other lilioid monocots [J]. Biol Rev, 2002, 77(3): 403-441. doi:10.1017/S1464793102005936.

[30] WANG M M, LIU M M, RAN F, et al. Global analysis oftranscription factor gene family inreveals their stress- and hormone-responsive patterns [J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(11): 3470. doi: 10.3390/ijms19113470.

[31] LI X X, LIU C, LI W, et al. Genome-wide identification, phylogenetic analysis and expression profiling of thefamily genes in[J]. Hereditas, 2016, 38(5): 444-460. doi: 10.16288/j.yczz.15-499.李曉旭, 劉成, 李偉, 等. 番茄轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定及其進化、表達分析 [J]. 遺傳, 2016, 38(5): 444-460. doi:10.16288/j.yczz.15-499.

[32] GEHRING W J, MüLLER M, AFFOLTER M, et al. The structure of the homeodomain and its functional implications [J]. Trends Genet, 1990, 6: 323-329. doi:10.1016/0168-9525(90)90253-3.

[33] SU Y H, ZHAO X Y, LIU Y B, et al. Auxin-inducedexpression is essential for embryonic stem cell renewal during somatic embryo- genesis in[J]. Plant J, 2009, 59(3): 448-460. doi:10.1111/ j.1365-313X.2009.03880.x.

[34] DU Z Y, CHEN M X, CHEN Q F, et al.acyl-CoA-binding protein ACBP1 participates in the regulation of seed germination and seedling development [J]. Plant J, 2013, 74(2): 294-309. doi:10.1111/ tpj.12121.

[35] DU M M, ZHAI Q Z, DENG L, et al. Closely related NAC trans- cription factors of tomato differentially regulate stomatal closure and reopening during pathogen attack [J]. Plant Cell, 2014, 26(7): 3167- 3184. doi:10.1105/tpc.114.128272.

[36] PéRET B, DE RYBEL B, CASIMIRO I, et al.lateral root development: An emerging story [J]. Trends Plant Sci, 2009, 14(7): 399-408. doi:10.1016/j.tplants.2009.05.002.

[37] PALOVAARA J, HAKMAN I. Conifer-related homeodomain transcription factors, developmental consideration and expression dynamic ofduringsomatic embryogenesis [J]. Plant Mol Biol, 2008, 66(5): 533-549. doi:10.1007/s11103-008-9289-5.

[38] ZHANG T Q, LIAN H, ZHOU C M, et al. A two-step model for de novo activation ofduring plant shoot regeneration [J]. Plant Cell, 2017, 29(5): 1073-1087. doi:10.1105/tpc.16.00863.

[39]CHENG S F, TAN F, LU Y, et al. WOX11 recruits a histone H3K27me3 demethylase to promote gene expression during shoot development in rice [J]. Nucl Acids Res, 2018, 46(5): 2356-2369. doi:10.1093/nar/ gky017.

Identification and Analysis of WOX Transcription Factor in

ZENG Dan-qi1,2, ZHANG Ming-ze1, HE Chun-mei1, WANG Hao-bin1,2, YU Zhen-ming1, SI Can1,2, ZHAO Cong-hui1,2, LI Dong-mei3, DUAN Jun1*

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049, China; 3. Shunde Polytechnic,Foshan 528300, Guangdong, China)

In order to understand the function of transcription factor WOX in, the WOX family members inwere identified by whole genome analysis techniques, the bioinformatics of WOXs and expression patterns ofwere analyzed. The results showed that there were ninetranscription factors ingenome, named DoWOX 1to DoWOX 9, respectively. The most ofcontained 2-3 exons, whilehad only one exon. The promoters ofcontained-regulatory elements related to hormone induction, stress responsive, plant growth and development. The expression of,,,andwere the highest at protocorm-like body (PLB) stage by qPCR, which ofwas the highest at small flower bud stage, and then decreased. In addition, the expressions of,andwere the highest in columns, and that ofwas the highest in lips. Therefore,might be involved in regulating the growth and development of,and play an important role in maintenance of PLBs state and flower development.

; WOX transcription factor; Bioinformatics analysis; Gene expression; qPCR

10.11926/jtsb.4294

2020-08-18

2020-09-23

中國科學院華南農(nóng)業(yè)植物分子分析與遺傳改良重點實驗室開放課題(KF202008)；廣州市科技計劃項目(201707010345)資助

This work was supported by the Open Project of Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Genetic Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences (Grant No. KF202008); and the Project for Science and Technology Planning in Guangzhou (Grant No. 201707010345).

曾丹琦(1997～ )，女，碩士研究生，從事鐵皮石斛生物技術(shù)育種研究。E-mail: ZengDanqi20@scbg.ac.cn

Corresponding author. E-mail: duanj@scib.ac.cn