張立新，王曉穎，和思燏，白君娥，朱祥瑞，梅 健，馬 翠△

（1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶分校醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與技術(shù)學(xué)院，2黑龍江省慢性病基礎(chǔ)研究與健康管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶163319；3哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150081）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種與炎癥相關(guān)的進(jìn)行性血管損傷性疾病，其病理特性主要是持續(xù)性的肺血管收縮，肺循環(huán)阻力增強(qiáng)，右心室肥厚，最終導(dǎo)致右心衰竭和死亡［1-3］。PH的發(fā)病機(jī)制與肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary arterial endothelial cells，PAECs）的不穩(wěn)定有關(guān)，在病理狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞能釋放大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），可通過調(diào)節(jié)不同類型的激酶和磷酸化酶，促進(jìn)黏附連接蛋白和肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架磷酸化，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，引起內(nèi)皮細(xì)胞及血管損傷［4-6］。線粒體動(dòng)態(tài)變化參與內(nèi)皮細(xì)胞的多個(gè)生理進(jìn)程如細(xì)胞內(nèi)的鈣平衡、ATP生成、ROS產(chǎn)生及氧化應(yīng)激，其中線粒體產(chǎn)生的ROS是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的主導(dǎo)因素，在維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的穩(wěn)定性方面扮演著重要角色［7-10］。Mito-Tempo是具有超氧化物和烷基自由基清除特性的線粒體靶向抗氧化劑，其在PH中的作用，特別是能否減輕PAECs的功能障礙仍有待研究。本研究擬通過構(gòu)建脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的PAECs炎癥損傷模型，探討Mito-Tempo對(duì)PAECs的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑

Tempol和Mito-Tempo購于Enzo Life Sciences；MTT、RIPA蛋白裂解液、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠和GreenNuc?活細(xì)胞caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室和Matrigel購于BD；抗發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）、p-Drp1和電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）抗體購于Abcam；四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）與MitoSOX購于Thermo Fisher。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 牛PAECs的原代培養(yǎng)與鑒定本研究獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。取新生小牛肺臟放于超凈臺(tái)內(nèi)，手術(shù)剪分離出肺主動(dòng)脈，放置在HEPES緩沖液中清洗，使用手術(shù)刀片輕輕地刮下肺主動(dòng)脈內(nèi)皮層，放入膠原酶中消化30 min，1×PBS洗掉膠原酶，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中，3 d后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)特征和細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)內(nèi)皮標(biāo)志物CD31來鑒定PAECs。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)將密度為每孔5 000個(gè)細(xì)胞的PAECs接種到96孔培養(yǎng)板中并置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右時(shí)饑餓處理過夜，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，向細(xì)胞中加入含有0.5%MTT的無色培養(yǎng)基，避光溫育4～6 h，棄去培養(yǎng)液并向細(xì)胞中加入150μL DMSO，振蕩，10 min后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的吸光度（A）。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PAECs接種到6孔培養(yǎng)板中并置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，饑餓處理過夜，用100～200μL移液管槍頭輕劃出一道1 mm寬痕，1×PBS清洗后按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理，在0 h和24 h后對(duì)相同的劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照。

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)將濾膜孔徑為8μm的Boyden小室置于24孔培養(yǎng)板中，小室下層加入5%FBSDMEM培養(yǎng)基。將處理好的PAECs用胰蛋白酶消化處理并重懸于無血清培養(yǎng)液中，然后按照細(xì)胞數(shù)為每孔8×104接種到Boyden小室上室中，加藥處理后置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。隨后取出小室，用棉簽輕檫掉小室上層未遷移的細(xì)胞。將遷移細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.4%結(jié)晶紫染色10 min，蒸餾水清洗3遍，顯微鏡觀察并拍照計(jì)數(shù)。

2.5 小管形成實(shí)驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板中加入30μL提前融化成液體的Matrigel，并在37℃下固化30 min。將PAECs用胰蛋白酶消化處理并制成濃度為5×107/L的細(xì)胞懸液，吸取200μL細(xì)胞懸液接種于每個(gè)孔中，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理后置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察小管形成后拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定小管長(zhǎng)度。

2.6 MitoSox與TMRM染色將按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理后的PAECs與MitoSOX?Red線粒體超氧化物指示劑（5μmol/L）或TMRM（0.1μmol/L）37℃避光孵育20～30 min，PBS清洗3遍。使用尼康TE2000顯微鏡觀察拍照（激發(fā)波長(zhǎng)514 nm/發(fā)射波長(zhǎng)585 nm）。

2.7 線粒體形態(tài)及氧化狀態(tài)檢測(cè)將線粒體靶向表達(dá)氧化還原反應(yīng)敏感性GFP的Mito-roGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，作用24 h后使用激光共聚焦顯微鏡拍照觀察線粒體形態(tài)。將獲得的圖像使用ImageJ軟件進(jìn)行線粒體片段化量化分析，以線粒體片段化指數(shù)（mitochondrial fragmentation index，MFI）表示。使用多邊形選擇工具選擇單個(gè)的細(xì)胞，復(fù)制并轉(zhuǎn)移到新的獨(dú)立圖像文件中。轉(zhuǎn)換線粒體圖像為8位灰度圖像。調(diào)整合適的圖像閾值，使線粒體的成像明顯區(qū)別于背景。將圖像轉(zhuǎn)換為二值圖像，計(jì)算非連續(xù)的線粒體片段的數(shù)量和線粒體中的像素?cái)?shù)量。MFI的計(jì)算方法是將非相鄰片段數(shù)除以像素?cái)?shù)，再乘以1 000［11］。為了確定細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，細(xì)胞分別給予405 nm和488 nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)，隨后于525 nm波長(zhǎng)處獲取熒光照片。每分鐘對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成像，持續(xù)30 min，并測(cè)量405 nm（氧化）和488 nm（還原）熒光強(qiáng)度的比值以確定每個(gè)細(xì)胞的相對(duì)氧化還原狀態(tài)。

2.8 細(xì)胞免疫熒光觀察將預(yù)先處理好的細(xì)胞使用1×PBS清洗3遍，4%多聚甲醛4℃固定15 min，1×PBS清洗3遍，0.01%Triton X-100室溫孵育細(xì)胞10 min透化細(xì)胞膜，1×PBS緩沖液清洗3遍，5%BSA封閉細(xì)胞30 min后，將Ⅰ抗（抗Drp1抗體，1∶50）滴加到細(xì)胞上，4℃孵育過夜。第2天PBS清洗3遍，Ⅱ抗（Cy3）37℃避光孵育2 h，1×PBS清洗3遍，DAPI避光室溫染核10 min，PBS緩沖液清洗3遍。使用尼康TE2000顯微鏡觀察拍照。

2.9 Western blot實(shí)驗(yàn)將預(yù)先處理好的細(xì)胞使用PBS緩沖液清洗3遍，吸盡PBS緩沖液，加入帶有PMSF的蛋白裂解液，冰上孵育15 min，刮刀收集細(xì)胞裂解液，4℃、13 500 r/min離心15 min，吸取上清液即是細(xì)胞總蛋白。取30～50μg蛋白樣品，按照每100μL蛋白加入25μL 5×SDSLoading Buffer，混勻，放在100℃煮樣器中5 min，-80℃保存。按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同的蛋白樣品和蛋白Marker，10%Tris-HCl SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)膜2 h，按照分子量剪膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃孵育Ⅰ抗（抗β-actin抗體，1∶1 000；抗Drp1和p-Drp1抗體，1∶500）過夜。第2天孵育不同比例的Ⅱ抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，1∶5 000～1∶10 000），室溫孵育1 h。用ECL工作液室溫孵育NC膜5 min后顯影使用ImageJ軟件分析目的蛋白相對(duì)密度。

2.10 caspase-3活性的檢測(cè)將密度為每孔5 000個(gè)細(xì)胞的PAECs接種到96孔培養(yǎng)板中并置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右時(shí)饑餓處理過夜，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照GreenNuc?活細(xì)胞caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說明書要求進(jìn)行樣品處理，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的A值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用t檢檢，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS誘導(dǎo)PAECs損傷，凋亡增加

MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度（0、0.1、1和5 mg/L）的LPS作用24 h對(duì)PAECs活力的影響，結(jié)果表明LPS濃度為1 mg/L時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯損傷，見圖1A。同時(shí)通過caspase-3活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度（0、0.1、1和5 mg/L）的LPS作用24 h對(duì)PAECs凋亡的影響，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡程度隨著LPS濃度的升高而顯著增強(qiáng)，見圖1B。綜合以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定1 mg/L LPS為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

Figure 1.LPSinduced apoptosis of PAECs.A：the viability of PAECs after treatment with different concentrations of LPSfor 24 h was detected by MTT assay；B：the apoptosis of PAECs after treatment with different concentrations of LPSfor 24 h was measured by caspase-3 activity detection assay.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs0 mg/L group.圖1 LPS誘導(dǎo)凋亡，促進(jìn)PAECs損傷

2 LPS誘導(dǎo)PAECs氧化應(yīng)激及線粒體功能異常

PAECs轉(zhuǎn)染Mito-roGFP腺病毒后檢測(cè)細(xì)胞線粒體形態(tài)和氧化狀態(tài)，如圖2A所示，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體分裂，線粒體片段化增加，同時(shí)促進(jìn)線粒體氧化應(yīng)激。線粒體膜電位測(cè)定結(jié)果顯示，LPS導(dǎo)致PAECs的線粒體去極化，見圖2B。同時(shí)線粒體ROS熒光探針MitoSOX染色結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)線粒體中ROS產(chǎn)量增加，見圖2C。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，損傷PAECs的線粒體形態(tài)和功能。

Figure 2.LPSinduced oxidative stress and mitochondrial dysfunction of PAECs.A：mitochondrial fission［indicated by mitochondrial fragmentation index（MFI）］and oxidative status（indicated by the ratio of fluorescence at 405/488 nm）of PAECs induced by LPSwere detected after infection with Mito-roGFP；B：tetramethylrhodamine methyl ester（TMRM）staining was used to assess mitochondrial polarization；C：representative images of mitochondrially targeted superoxide indicator Mito-SOX staining.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs control（CON）group.圖2 LPS誘導(dǎo)PAECs氧化應(yīng)激及線粒體功能異常

3 Mito-Tempo抑制LPS誘導(dǎo)的PAECs氧化應(yīng)激及線粒體功能損傷

為了探究抗氧化劑Tempol和Mito-Tempo是否能夠緩解LPS誘導(dǎo)的PAECs氧化應(yīng)激及線粒體損傷，分別給予細(xì)胞Tempol及Mito-Tempo（10 mmol/L）處理［11］，Mito-roGFP腺病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，Mito-Tempo明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體片段化和氧化應(yīng)激，但Tempol抑制效果相對(duì)較弱，見圖3A。另外，我們發(fā)現(xiàn)LPS+Mito-Tempo組的線粒體去極化水平較LPS組顯著下降，而LPS+Tempol組的線粒體去極化水平無明顯變化，見圖3B。MitoSOX結(jié)果表明，使用Mito-Tempo處理細(xì)胞后，與LPS組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯下降，見圖3C。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Mito-Tempo明顯減輕LPS誘導(dǎo)的PAECs氧化應(yīng)激及線粒體形態(tài)和功能損傷。

4 Mito-Tempo抑制LPS激活的Drp1磷酸化

為了確定LPS誘導(dǎo)的線粒體功能障礙是否與Drp1激活有關(guān)，我們采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，紅色熒光標(biāo)記Drp1，綠色熒光標(biāo)記線粒體標(biāo)志蛋白VDAC。結(jié)果顯示，Drp1在胞質(zhì)及線粒體中大量分布，且LPS促進(jìn)Drp1的表達(dá)，Tempol和Mito-Tempo處理可降低Drp1的表達(dá)水平，見圖4A。同時(shí)，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tempol和Mito-Tempo處理抑制了LPS導(dǎo)致的Drp1和p-Drp1蛋白水平升高，其中Mito-Tempo的抑制效果更為顯著，見圖4B。

5 Mito-Tempo減輕LPS誘導(dǎo)的PAECs凋亡

MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，與LPS組相比，LPS+Mito-Tempo組的細(xì)胞活力明顯增加（P＜0.05），LPS+Tempol組的細(xì)胞活力無明顯改變，見圖5A。同時(shí)caspase-3活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LPS組相比，LPS+Mito-Tempo組的細(xì)胞損傷減輕，但Tempol處理不能抑制細(xì)胞凋亡，見圖5B。以上實(shí)驗(yàn)證明Mito-Tempo可顯著抑制LPS引起的PAECs損傷。

6 Mito-Tempo抑制LPS導(dǎo)致的PAECs功能異常

Figure 3.Mito-Tempo（Mito-T）inhibited LPS-induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction of the PAECs.A：the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on mitochondrial fission and oxidative status；B：the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on mitochondrial polarization induced by LPS；C：MitoSOX staining was used to detect the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on ROSproduction induced by LPS.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.05 vs LPSgroup.圖3 Mito-Tempo抑制LPS誘導(dǎo)的PAECs的氧化應(yīng)激及線粒體功能損傷

PAECs的功能異常會(huì)導(dǎo)致其遷移及管腔形成功能受損［12］。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)LPS誘導(dǎo)24 h后PAECs的遷移能力下降，劃痕愈合程度明顯低于正常組；Tempol和Mito-Tempo處理組較LPS組劃痕愈合程度有所增加，且Mito-Tempo作用更為顯著（P＜0.01），見圖6A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞穿過小室的數(shù)量明顯少于正常組；LPS+Mito-Tempo組的細(xì)胞遷移能力有所增加；LPS+Tempol處理組與LPS組相比無明顯改變，見圖6B。小管形成實(shí)驗(yàn)表明，LPS刺激縮短了管腔形成長(zhǎng)度；與LPS處理組相比，LPS+Mito-Tempo組的小管形成長(zhǎng)度明顯得到恢復(fù)，LPS+Tempol處理組的小管形成長(zhǎng)度無恢復(fù)，見圖6C。以上結(jié)果說明Mito-Tempo能明顯抑制LPS導(dǎo)致的PAECs功能異常。

討 論

血管內(nèi)膜層的內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)破壞在PH肺血管重構(gòu)的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［13］。在正常狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞通過一種肌-內(nèi)皮連接方式維護(hù)著平滑肌細(xì)胞的穩(wěn)定，內(nèi)皮細(xì)胞完整性對(duì)于維持血管正常的生理結(jié)構(gòu)及功能具有重要的意義［14］。PH病變發(fā)生時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞在通透性、抗凝作用和炎癥反應(yīng)等方面均發(fā)生顯著變化，從而損傷了肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能［15］。大量研究表明，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致PH發(fā)生發(fā)展的重要因素，一方面附著在內(nèi)皮細(xì)胞上的炎癥細(xì)胞可分泌大量炎癥因子，從而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷；另一方面炎癥細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子和趨化因子能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的過度增殖和凋亡抑制，進(jìn)而促進(jìn)了PH的發(fā)展［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激PAECs導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、遷移及管腔形成能力受損，進(jìn)而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的分子機(jī)制展開探索。

線粒體在細(xì)胞的正常生命進(jìn)程中起著決定性作用，它參與細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)的傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞增殖和凋亡過程［18-20］。大量研究表明Drp1是調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白，炎癥及缺氧等多種因素可導(dǎo)致Drp1的異常表達(dá)［21-22］。在病理?xiàng)l件下，細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，而ROS大部分來源于線粒體，線粒體內(nèi)ROS的聚集會(huì)損傷線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)Drp1的表達(dá)及磷酸化增多，共同導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［23-24］。因此，線粒體形態(tài)和功能異常是導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損的重要誘因。我們的前期研究顯示線粒體ROS與Drp1的正反饋調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)缺氧性PAECs增殖，提示線粒體ROS與Drp1在PH疾病發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。

Figure 4.Mito-Tempo（Mito-T）inhibits Drp1 expression and phosphorylation activated by LPS.A：the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on fluorescence of Drp1 induced by LPS；B：the effect of T or Mito-T（10 mmol/L）on the protein levels of Drp1 and p-Drp1 induced by LPS.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.01，##P＜0.01 vs LPSgroup.圖4 Mito-Tempo抑制LPS激活的Drp1表達(dá)和磷酸化

Figure 5.Mito-Tempo（Mito-T）attenuated apoptosis of PAECs induced by LPS.A：the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on the viability of PAECs induced by LPS；B：the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on the apoptosis of PAECs induced by LPS.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.05 vs LPSgroup.圖5 Mito-Tempo減輕LPS誘導(dǎo)的PAECs凋亡

Figure 6.Mito-Tempo（Mito-T）inhibited the dysfunction of PAECs caused by LPS.A and B：scratch assay and Transwell method were used to detect the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on the migration ability of PAECs induced by LPS；C：the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on the tube formation ability of PAECs induced by LPS.Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs control（CON）group；##P＜0.01 vs LPSgroup.圖6 Mito-Tempo抑制LPS導(dǎo)致的PAECs功能異常

Mito-Tempo是線粒體靶向抗氧化劑，其結(jié)構(gòu)中含有氮自由基，具有類似于超氧化物歧化酶的活性，起到抗氧化應(yīng)激的作用，同時(shí)易于轉(zhuǎn)化成具有清除氧自由基作用的羥胺結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步增加了其自身的抗氧化能力［25-26］。既往研究表明，Mito-Tempo在神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、心血管疾病等炎性疾病中都有一定的治療效果，但其對(duì)于PH機(jī)制是否具有調(diào)控作用仍未明確［27-29］。

本研究證實(shí)LPS所致PAECs的功能障礙與線粒體穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)。使用LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞線粒體分裂增多、氧化性增強(qiáng)、去極化水平升高、ROS產(chǎn)量增加以及Drp1表達(dá)活化增多；而給予Mito-Tempo處理能抑制LPS所致的線粒體分裂增多，并抑制氧化應(yīng)激、線粒體去極化水平、ROS產(chǎn)量及Drp1表達(dá)和磷酸化，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們認(rèn)為Mito-Tempo對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能依賴于Mito-Tempo的抗氧化應(yīng)激能力，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)初步探討了Mito-Tempo對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其分子機(jī)制，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中Mito-Tempo是否具有抑制PH發(fā)生發(fā)展的作用仍需要在未來的實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證。