張書(shū)婭，邵鐘銘，伍彩霞，劉曉曉，鄒 園，揭 偉，△，郭峻莉△

（1海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院海南省熱帶心血管病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南醫(yī)學(xué)院急救與創(chuàng)傷研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71199；2廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東湛江524023）

當(dāng)前全球糖尿病患病率增長(zhǎng)迅速且居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年糖尿病患病數(shù)僅在20～79歲年齡段全世界就有4.63億；預(yù)計(jì)到2045年，這個(gè)數(shù)字將會(huì)增加超過(guò)7億［1］。血糖持續(xù)控制不良的情況下，糖尿病血管并發(fā)癥的患病率、致殘率和致死率也相應(yīng)增加。血管功能障礙在糖尿病血管并發(fā)癥易感性方面起著重要作用，也是獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［2］。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，并且是多能干細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)研究中具有重要的地位［3］。糖尿病狀態(tài)下EPCs數(shù)量和功能受損是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的重要機(jī)制。在血管受到缺血或缺氧刺激時(shí)，骨髓來(lái)源的EPCs可從骨髓動(dòng)員到外周血并趨化遷移至缺血損傷部位分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成新生血管，直接發(fā)揮其血管新生作用，也可通過(guò)分泌促血管新生的細(xì)胞因子以“旁分泌”的形式間接發(fā)揮其促血管新生的作用［4-5］。因而，EPCs的數(shù)量及增殖、遷移和分化等功能與血管疾病進(jìn)程和死亡率呈負(fù)相關(guān)［6-7］。

Rho家族GTP酶3（Rho family GTPase 3，Rnd3）是小GTP酶Rho家族的Rnd亞家族成員［8-9］，可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RhoA的靶分子ROCK1而拮抗RhoA的生物學(xué)功能，在細(xì)胞的骨架和極性維持、周期、凋亡、遷移及黏附過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用［10-13］。早期有研究顯示［14］，與消瘦的非糖尿病人群相比，伴有肥胖的Ⅱ型糖尿病患者的骨骼肌組織中Rnd3表達(dá)增加，ROCK1活性減少，初步提出了糖尿病狀態(tài)與Rnd3表達(dá)之間的關(guān)系。本課題組前期結(jié)果顯示，Rnd3表達(dá)不足抑制了心肌梗死后血管新生，因而是體內(nèi)調(diào)控血管新生的重要因子［15］。關(guān)于Rnd3與EPCs功能的關(guān)系，特別是在糖尿病狀態(tài)下的影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在應(yīng)用Rnd3基因敲除的大鼠，首次探討糖尿病狀態(tài)下Rnd3改變對(duì)骨髓源性EPCs一般生物學(xué)特性的影響，為后續(xù)相關(guān)機(jī)制和在體研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雌性和雄性Rnd3基因敲除的雜合子（Rnd3+/-）Sprague-Dawley（SD）大鼠均由江蘇賽業(yè)生物科技有限公司提供，許可證號(hào)為SYXK（粵）2015-0147。Rnd3+/-大鼠飼養(yǎng)并繁殖于廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，子代鼠經(jīng)基因型分析，分別得到Rnd3+/-和野生型（wild-type，WT）大鼠。

2 材料和主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和鏈脲佐菌素（Sigma）；EGM-2專(zhuān)用培養(yǎng)基（LONZA）；FITC-UEA-1和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Gibco；大鼠淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊锕荆籇iI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-acLDL）購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司；抗β-actin抗體（Santa Cruz）；抗caspase-3抗體（CST）；抗Bcl-2抗體（Proteintech）；增強(qiáng)型CCK-8試劑盒（碧云天）；Matrigel和Transwell小室（Corning）；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）ELISA試劑盒（R&D）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 糖尿病SD大鼠模型建立與分組委托江蘇賽業(yè)生物公司基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Rnd3基因敲除SD大鼠，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定合格的Rnd3+/-大鼠用于后代繁育，得到Rnd3+/-和WT大鼠。分別使用成年Rnd3+/-和WT大鼠來(lái)構(gòu)建糖尿病動(dòng)物模型，參考既往報(bào)道進(jìn)行［16］。簡(jiǎn)言之，使用高脂飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周。將STZ與檸檬酸鈉緩沖液混勻，配制終濃度為10 g/L。實(shí)驗(yàn)組予STZ溶液以60 mg/kg一次性腹腔注射，對(duì)照組注射等比例檸檬酸鈉緩沖液。期間飼以高脂飼料。STZ注射3周后，以連續(xù)2次空腹血糖值≥16.7 mmol/L為建模成功。實(shí)驗(yàn)分為4組：WT對(duì)照（WT-Ctrl）組、WT糖尿?。╓T-DM）組、Rnd3基因敲除雜合子對(duì)照（Rnd3+/--Ctrl）組和Rnd3基因敲除雜合子糖尿?。≧nd3+/--DM）。每組20只大鼠。

3.2 大鼠骨髓源性EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定采用既往報(bào)道方法進(jìn)行［17］。簡(jiǎn)言之，大鼠經(jīng)阿佛汀完全麻醉后，將雙下肢迅速剝離，注意保持完整性。使用RPMI-1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，經(jīng)70μm濾網(wǎng)過(guò)濾。采用大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞，RPMI-1640培養(yǎng)基清洗1次。將得到的細(xì)胞加入EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用完全培養(yǎng)基，輕輕重懸底層細(xì)胞。培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。48 h后吸取上清，二次接種于新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。以后每48～72 h用EGM-2完全培養(yǎng)基換液。收集第3代貼壁細(xì)胞，加入10 mg/L的DiI-acLDL，避光于37℃孵育4 h；PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定20 min；加入10 mg/L的FITC-UEA-1，避光孵育1 h，PBS漂洗3次，加入抗熒光淬滅封片液封片。使用激光掃描共聚焦顯微鏡鑒定。DiI-acLDL和FITC-UEA-1表達(dá)雙陽(yáng)性可以鑒定為EPCs［18］。本實(shí)驗(yàn)所用的EPCs未做純度檢測(cè)。

3.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力取WT-Ctrl、WT-DM、Rnd3+/--Ctrl和Rnd3+/--DM組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代EPCs以每孔3×103接種于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔。每孔加入10μL CCK-8試劑，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀上讀取450 nm的吸光度（A）值。共設(shè)置0 d、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d共6個(gè)時(shí)點(diǎn)。

3.4 Western blot檢測(cè)各組EPCs的細(xì)胞凋亡相關(guān)分子的表達(dá)分別提取各組第2代EPCs總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔按35μg蛋白上樣，經(jīng)12%的SDS-PAGE分離。蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，各膜經(jīng)含5%BSA的TBST室溫?fù)u床上封閉2 h，TBST洗滌2次后與相應(yīng)Ⅰ抗過(guò)夜4℃孵育?？贵w使用情況如下：Bcl-2，1∶500；caspase-3，1∶1 000；β-actin，1∶2 000。TBST洗滌15 min×3遍，各膜再與HRP-標(biāo)記IgG室溫下結(jié)合1 h，洗滌后經(jīng)ECL發(fā)光液顯影，天能凝膠成像分析系統(tǒng)掃描和分析條帶。

3.5 Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)第2代細(xì)胞以無(wú)血清同步化2 h，各組細(xì)胞以每孔2×104的數(shù)量（總體積200μL，含0.5%FBS）接種于Transwell小室的上室，下室每孔加入500μL含10%FBS的EGM-2完全培養(yǎng)液，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS清洗小室2遍，用棉簽輕輕擦去微孔膜上層的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定20 min后，結(jié)晶紫染色30 min，三蒸水漂洗3次，晾干，倒置顯微鏡觀(guān)察，拍照計(jì)數(shù)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

3.6 ELISA檢測(cè)EPCs上清液中VEGF含量分別將同樣數(shù)量的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第2代EPCs接種于6孔板，收集24 h貼壁后各孔內(nèi)細(xì)胞上清標(biāo)記為0 d組，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3 d后再次收集未換液的細(xì)胞上清，標(biāo)記為3 d組。根據(jù)ELISA試劑盒配制所有試劑與樣品進(jìn)行VEGF濃度檢測(cè)。每組3個(gè)復(fù)孔。

3.7 EPCs成管實(shí)驗(yàn)48孔板每孔加入100μL稀釋后的Matrigel，放入37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。第2代EPCs用無(wú)血清EBM-2培養(yǎng)基饑餓處理2 h，以每孔2×104的密度接種于Matrigel上，37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后，置于光鏡下觀(guān)察，拍照，使用ImageJ軟件處理圖片。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析進(jìn)行Tukey兩兩對(duì)比分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功分離大鼠骨髓源性EPCs

分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)EGM-2培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)7 d后，可觀(guān)察到細(xì)胞呈簇狀，周?chē)仕笮螢橹鞑⒎派錉钌L(zhǎng)，集落中央的細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞較小。繼續(xù)培養(yǎng)至21 d左右，細(xì)胞形態(tài)相互融合呈典型的“鋪路石”狀（圖1A）。在熒光顯微鏡下觀(guān)察，吞噬DiI-acLDL的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光標(biāo)記，特異結(jié)合FITC-UEA-1的細(xì)胞呈綠色熒光，同時(shí)攝取DiI-acLDL又結(jié)合FITC-UEA-1呈橘黃色熒光標(biāo)記的雙陽(yáng)性即為EPCs（圖1B）。

Figure 1.The morphological and functional identification of EPCs.A：morphological change of EPCs at 21 d；B：functional identification of EPCs under fluorescence microscope.The scale bar=150μm.圖1 EPCs的形態(tài)與功能鑒定

2 糖尿病狀態(tài)增強(qiáng)了Rnd3基因敲除對(duì)EPCs的活力的抑制效應(yīng)

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于WT-Ctrl組，WTDM組在3 d時(shí)細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05），Rnd3+/--Ctrl組在5 d時(shí)顯示出顯著下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.05）。與WT-Ctrl和Rnd3+/--Ctrl組對(duì)比，Rnd3+/--DM在各時(shí)點(diǎn)均顯示了顯著的下降趨勢(shì)（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2.Insufficient expression of Rnd3 promoted the inhibitory effect of diabetes on the viability of EPCs.Mean±SD.n=3-6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT-DMgroup；#P＜0.05，##P＜0.01 vs WT-Ctrl group.圖2 Rnd3表達(dá)不足促進(jìn)了糖尿病對(duì)EPCs活性的抑制效應(yīng)

3 糖尿病狀態(tài)下Rnd3基因敲除改變EPCs中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

使用Western blot檢測(cè)各組EPCs中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和caspase-3的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。凋亡抑制蛋白Bcl-2在Rnd3+/--Ctrl組與Rnd3+/--DM組相較于WT-Ctrl組EPCs中的表達(dá)都表現(xiàn)為下降，而促進(jìn)凋亡蛋白總caspase-3則表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。本研究中未檢測(cè)活化的caspase-3蛋白。

Figure 3.Insufficient expression of Rnd3 changed the expression of apoptosis-related proteins in EPCs from diabetic rats.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT-Ctrl group；#P＜0.05 vs WT-DM group.圖3 Rnd3表達(dá)不足改變了糖尿病對(duì)EPCs凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

4 糖尿病狀態(tài)下Rnd3敲除抑制EPCs的細(xì)胞遷移能力

Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），相對(duì)于WT-Ctrl組，WT-DM和Rnd3+/--Ctrl組穿過(guò)PVDF膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降（P＜0.05）；與Rnd3+/--Ctrl組對(duì)比，Rnd3+/--DM組遷移能力進(jìn)一步下降（P＜0.05）。

5 糖尿病狀態(tài)下Rnd3敲除抑制EPCs分泌VEGF

應(yīng)用ELISA檢測(cè)各組EPC釋放至培養(yǎng)液上清中VEGF濃度的結(jié)果顯示，與WT-Ctrl組相比較，WTDM組和Rnd3+/--Ctrl組EPCs釋放VEGF水平均明顯減弱，提示糖尿病和Rnd3表達(dá)減弱均顯著抑制了EPCs釋放VEGF；與Rnd3+/--Ctrl組相比，Rnd3+/--DM組3 d時(shí)VEGF濃度與Rnd3+/--Ctrl組相似，均處于與0 d時(shí)相似的基線(xiàn)水平，已無(wú)進(jìn)一步下調(diào)的空間（圖5）。

6 糖尿病狀態(tài)下Rnd3敲除減弱了EPCs的血管樣結(jié)構(gòu)形成能力

成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病顯著抑制了EPCs的血管樣結(jié)構(gòu)形成能力，而Rnd3敲除則進(jìn)一步加劇了糖尿病對(duì)EPCs血管樣結(jié)構(gòu)形成能力的抑制效應(yīng)（圖6）。

討 論

Figure 4.Defects in Rnd3 expression amplified the inhibitory effect of diabetes on the migration of EPCs.The scale bar=200μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs WT-Ctrl group；#P＜0.05 vs Rnd3+/--Ctrl group.圖4 Rnd3敲除放大了糖尿病對(duì)EPCs遷移的抑制效應(yīng)

Figure 5.Insufficient expression of Rnd3 deteriorated the inhibitory effect of diabetes on the secretion of VEGF in EPCs（2×105 cells）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs WT-Ctrl group；##P＜0.01 vs WT-DMgroup；△△P＜0.01 vs day 0.圖5 Rnd3敲除惡化了糖尿病對(duì)EPCs中VEGF分泌的抑制作用

Figure 6.Insufficient expression of Rnd3 deteriorated the inhibitory effect of diabetes on the ability of EPCs to form tube-like structures.The scale bar=200μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs WT-Ctrl group；#P＜0.05 vs Rnd3+/--Ctrl group；△P＜0.05 vs WT-DMgroup.圖6 Rnd3敲除惡化了糖尿病對(duì)EPCs血管樣結(jié)構(gòu)形成能力

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是糖尿病血管并發(fā)癥的根本原因。糖尿病傷口局部血管新生及傷口愈合與EPCs的數(shù)量及功能密切相關(guān)［19-20］。已經(jīng)證實(shí)，無(wú)論是I型糖尿病還是II型糖尿病患者，其外周血EPCs的數(shù)量和血管生成功能均顯著下降［21-22］，但相關(guān)的機(jī)制仍不明確。因而，明確糖尿病患者EPCs數(shù)量減少及功能受損的機(jī)制，從而尋找合適靶點(diǎn)來(lái)改善患者自體EPCs增殖和遷移等功能，并提高其分泌促血管新生因子的能力，可能為將來(lái)EPCs移植治療糖尿病缺血性心血管病提供重要的理論基礎(chǔ)。

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下野生型EPCs要比正常狀態(tài)下EPCs中Rnd3蛋白的表達(dá)減少（未發(fā)表資料），同時(shí)鑒于前期觀(guān)察到Rnd3表達(dá)不足后顯著抑制了心肌梗死后的血管生成能力［15］，我們?cè)O(shè)想Rnd3不足也可能影響了EPCs的功能。為此，本研究基于CRISPR/Cas9技術(shù)編輯了大鼠Rnd3基因，獲得Rnd3基因敲除后的雜合子和WT鼠，復(fù)制了糖尿病模型，分離了骨髓源性EPCs，首次探索Rnd3不足對(duì)EPCs一般生物學(xué)特性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病狀態(tài)明顯減弱了野生型SD大鼠骨髓源性EPCs的活力、遷移和旁分泌VEGF能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)增加，功能上表現(xiàn)為成血管能力的削弱。這些結(jié)果與既往的他人報(bào)道的有關(guān)糖尿病損傷EPCs的基本生物學(xué)功能的結(jié)果高度一致［23-25］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rnd3表達(dá)與既往Chun等［14］的報(bào)道的在糖尿病患者骨骼肌中Rnd3表達(dá)上調(diào)的結(jié)果相反，其原因可能為Chun等［14］的報(bào)道納入對(duì)象為消瘦非糖尿病、肥胖非糖尿病和肥胖伴糖尿病三類(lèi)人群，肥胖伴糖尿病者與消瘦非糖尿病人群對(duì)比，組織中Rnd3表達(dá)是升高的；而本研究構(gòu)建的糖尿病大鼠是消瘦狀態(tài)。兩者實(shí)驗(yàn)對(duì)象的差異可能是Rnd3表達(dá)趨勢(shì)相反的根本原因。本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)，Rnd3表達(dá)不足明顯的增加了糖尿病對(duì)EPCs上述活力、遷移、旁分泌和血管生成等一般生物學(xué)特性的負(fù)性影響作用，但相關(guān)機(jī)制尚不明確。

Rnd3是缺乏GTP水解活性的非典型Rho GTP酶，該分子具有多種細(xì)胞生物學(xué)功能，在細(xì)胞增殖、周期、凋亡、遷移、極性化及分化中發(fā)揮重要作用［26-28］。Rnd3不足可影響HIF-1α的穩(wěn)定性而直接抑制HIF-1α下游靶基因VEGF的表達(dá)［15］。Rnd3缺陷也可通過(guò)影響p65和p50的穩(wěn)定性而促進(jìn)NF-κB信號(hào)的活化［29］。早期的報(bào)道顯示糖尿病心肌組織中HIF-1α表達(dá)下調(diào)而NF-κB信號(hào)是活化的［30-31］，由此，我們猜測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)的Rnd3不足導(dǎo)致EPCs相應(yīng)生物學(xué)功能的缺陷很可能也與HIF-1α和NF-κB信號(hào)的異?；罨嘘P(guān)。生物信息學(xué)分析表明，大鼠Rnd3基因啟動(dòng)子-2010～120 bp上具有3個(gè)低氧反應(yīng)元件，我們猜測(cè)Rnd3與HIF-1α之間極有可能形成信號(hào)調(diào)控反饋環(huán)路。因此很可能糖尿病時(shí)此調(diào)控反饋環(huán)路異常調(diào)節(jié)是Rnd3參與調(diào)控EPCs生物學(xué)特性的重要機(jī)制之一，但這一猜測(cè)還需進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

總之，本研究基于Rnd3基因編輯大鼠成功復(fù)制了II型糖尿病模型，首次發(fā)現(xiàn)Rnd3表達(dá)不足促進(jìn)了糖尿病對(duì)骨髓源性EPCs的活力、遷移、血管生成能力的負(fù)性影響，因而維持Rnd3表達(dá)在防止糖尿病血管并發(fā)癥上具有潛在的靶向干預(yù)價(jià)值。本研究未做EPCs純度分析，不能排除其中含有其他細(xì)胞的可能和由此對(duì)結(jié)果可靠性和結(jié)論可信度的影響。盡管為了保證EPC的質(zhì)量，我們?cè)趯?shí)際操作中是盡量用前2代細(xì)胞，以上結(jié)論仍需更多實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。