梅玲玉 韓 冬 巫麗云 郭 偉 劉昊昆 金俊琰楊云霞 朱曉鳴 解綬啟

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;3. 湖北省水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料工程技術(shù)研究中心, 武漢 430072)

碳水化合物作為供能物質(zhì), 有提高魚類對飼料蛋白利用率和節(jié)約養(yǎng)殖成本的作用。魚類攝食過高碳水化合物水平的飼料會(huì)致使魚體生長緩慢、糖代謝紊亂甚至引發(fā)代謝疾病[1—3]。魚類與小鼠糖代謝模式相似, 代謝速度相對緩慢[4]。魚體糖代謝調(diào)節(jié)主要包括激素調(diào)節(jié)與酶調(diào)節(jié)。研究表明, 魚類體溫相對較低, 代謝能力較差, 但魚類胰島素分泌量與人類差別不大, 暗示魚類存在非胰島素依賴血糖調(diào)節(jié)途徑[4—8]。伴隨魚類生長發(fā)育過程其消化器官功能不斷完善, 腸道菌群數(shù)量、組成和分布不斷變化, 對營養(yǎng)物質(zhì)的需求也不斷變化, 多種魚類被報(bào)道其生長發(fā)育過程中食性發(fā)生改變[9,10]。

已有研究表明, 魚體規(guī)格對糖利用能力有一定的影響。異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)幼魚攝食24%—32%淀粉水平的飼料時(shí)生長性能及飼料利用較好, 對飼料碳水化合物的最適需求量在30%左右[11—13], 而中規(guī)格(52 g左右)和大規(guī)格(129 g左右)異育銀鯽的最適飼料淀粉水平分別為29.2%和27.2%[11]。草魚(Ctenopharyngodon idella)幼魚(6.5 g左右)可以較好地利用33%—38%淀粉水平的飼料, 37%淀粉水平的飼料則顯著限制了大規(guī)格草魚(398 g左右)的生長[14,15], 青魚(Mylopharyngodon piceus)幼魚(3.5 g左右)攝食含20%淀粉飼料時(shí)獲得最大特定生長率和飼料效率[11], 青魚魚種(48 g左右)對飼料糊精的適宜需求量為20%左右[16]。綜上所述, 魚體在不同生長階段對飼料碳水化合物的需求有所差異, 可能與魚體生命周期不同階段生長速度的不同及新陳代謝能力的變化密切相關(guān)[17,18]。根據(jù)魚體不同生長階段對碳水化合物需求的不同來配制不同的飼料不僅可以促進(jìn)魚類生長, 還可以節(jié)約飼料蛋白質(zhì), 降低養(yǎng)殖成本, 減少氨氮排放。而目前關(guān)于不同規(guī)格魚體對營養(yǎng)元素需求差異的比較研究主要集中于蛋白質(zhì), 尚且缺乏較為系統(tǒng)的不同規(guī)格魚類對飼料淀粉需求差異的比較研究。因而本實(shí)驗(yàn)以中國較為廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚類異育銀鯽“中科3號”為養(yǎng)殖對象, 設(shè)計(jì)淀粉水平為3%、13%、23%、33%和43%五個(gè)梯度的飼料, 進(jìn)行周期為340d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn), 比較探究異育銀鯽全養(yǎng)殖周期不同階段對飼料淀粉的需求及糖代謝差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以秘魯魚粉和酪蛋白為主要蛋白源, 以魚油和豆油(1∶1)為主要脂肪源, 以玉米淀粉為主要碳水化合物源, 分別設(shè)計(jì)淀粉水平為3%(S3)、13%(S13)、23%(S23)、33%(S33)和43%(S43)五個(gè)處理組飼料, 將飼料原料粉碎后均勻混合, 魚油豆油1∶1均勻混合后再與原料混勻過40目篩, 飼料制粒后70℃烘干至水分為(10±1)%, 冷卻后儲(chǔ)存于4℃冷庫備用(表 1)。

1.2 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)于2016年8月18日至2017年7月20日在湖北省石首市老河漁場長江故道江段網(wǎng)箱進(jìn)行, 為期340d。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)養(yǎng)殖階段: 幼魚期(第63天取樣, D63)、養(yǎng)成前期(第110天取樣, D110)、越冬期(第223天取樣, D223)、越冬后(第275天取樣,D275)和養(yǎng)成中后期(第340天取樣, D340)。除去越冬期D223組外, 每個(gè)養(yǎng)殖階段實(shí)驗(yàn)魚投喂5種實(shí)驗(yàn)飼料(表 1), 每個(gè)飼料組4個(gè)平行, 共計(jì)20個(gè)網(wǎng)箱。

表 1 飼料配方及化學(xué)組成(%干物質(zhì))Tab. 1 Formulation and chemical composition of the experimental diets (% dry matter)

實(shí)驗(yàn)魚首先在江段網(wǎng)箱實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周,暫養(yǎng)飼料為5種實(shí)驗(yàn)飼料的等量混合飼料。實(shí)驗(yàn)開始前將實(shí)驗(yàn)魚饑餓24h, 隨機(jī)選取體格勻稱、健康活潑的實(shí)驗(yàn)魚60尾[初始體重(12.0±0.1) g]放入每個(gè)網(wǎng)箱中, 另取15尾實(shí)驗(yàn)魚作為初始樣品, 研究對象為異育銀鯽“中科3號”。實(shí)驗(yàn)期間每天飽食投喂3次(8:00、13:00和18:00), 越冬期間停止投喂實(shí)驗(yàn)飼料。整個(gè)實(shí)驗(yàn)均在自然光照周期及溫度條件下進(jìn)行, D63階段水溫為21.5—30.5℃, D110階段水溫為17.0—21.5℃, 越冬期水溫為3.8—17.3℃, D275階段水溫為17.3—23.5℃, D340階段水溫為18.3—25.8℃。養(yǎng)殖期間溶氧為5.01—6.88 mg/L, 氨氮含量為0.04—0.43 mg/L。

每次樣品采集前, 所有實(shí)驗(yàn)對象饑餓24h, 用MS-222(100 mg/L)將魚麻醉, 對所有網(wǎng)箱的魚分別計(jì)數(shù)稱重, 隨機(jī)挑選規(guī)格中等魚體6條稱量體長、體重和體寬, 實(shí)驗(yàn)魚靜脈取血后, 其中2條裝袋作為末樣; 其余解剖分離肝臟、肌肉和腸道組織, 置于–80℃冰箱保存。

1.3 樣品分析

魚體末樣用高壓滅菌鍋 (120℃, 101.33 kPa)處理20min, 冷卻后搗碎, 75℃烘干至恒重后粉碎。干物質(zhì)測定使用失重法于105℃烘箱烘干至恒重測定,粗蛋白使用凱氏定氮儀(FOSS Teacator, Haganas,Sweden)測定, 粗脂肪使用索氏抽提儀(Soxtec System HT6 Tecator, Haganas, Sweden)測定。灰分使用馬弗爐(湖北英山縣建力電爐制造廠, 湖北英山)于550℃焚燒至恒重進(jìn)行測定。

尾靜脈抽取血液至1.5 mL離心管(注射器和離心管均用0.2%肝素鈉浸潤), 以3500×g離心5min, 吸取透明上清制備血漿, 血漿葡萄糖和血漿膽固醇含量用全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞B(yǎng)S-460, 中國深圳)及其標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(氧化酶法)測定, 具體方法參見儀器使用說明。后腸淀粉酶測定使用南京建成生物工程研究所的試劑盒: 于660 nm波長下測定吸光度值。糖原測定使用南京建成生物工程研究所的試劑盒: 620 nm波長測定吸光度值, 具體方法參見試劑盒說明。

基因表達(dá)量的測定用Trizol (Invitrogen, USA)按其說明書步驟提取組織RNA, 1.2%瓊脂糖凝膠電泳測定其完整度, NanoDrop-2000光譜儀測定mRNA純度及濃度后用Invitrogen公司M-MLV Frist-Stand Synthesis System按其說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RTqRCR反應(yīng)體系為6 μL(3 μL Light Cycle?480 SYBR?GreenⅠ Master、0.24 μL Primer forward、0.24 μL Primer reverse和2.52 μL cDNA)。PCR反應(yīng)在羅氏Light Cycle 480 Ⅱ(Roche, Basel, Switzerlad)PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)熱5min, 三步擴(kuò)增(95℃變性10s, 60℃退火30s, 72℃延伸30s), 45個(gè)循環(huán)。引物序列見表 2。

表 2 RT-qPCR所用引物Tab. 2 Primers used in RT-qPCR

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后, 進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),顯著性水平設(shè)為P＜0.05, 差異顯著時(shí)對各處理組進(jìn)行Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果

2.1 飼料淀粉對全養(yǎng)殖周期異育銀鯽魚“中科3號”生長性能和魚體成分的影響

在幼魚期(2016年8月18日至2016年10月17日,第1至第63天, D63), 飼料淀粉水平高于23%處理組的異育銀鯽增重率、特定生長率及肥滿度顯著高于S13與S23組(P＜0.05), 飼料效率隨飼料淀粉水平上升總體呈上升趨勢。其中S23組生長表現(xiàn)最好,各處理組魚體蛋白含量無顯著差異, 魚體脂肪含量隨飼料淀粉水平升高呈先上升后穩(wěn)定的趨勢, S23處理組魚體脂肪含量最高。在養(yǎng)成前期(2016年10月18日至2016年12月03日, 第64至第110天,D110), 不同處理組異育銀鯽增重率、攝食率、飼料效率、特定生長率及肥滿度隨飼料淀粉水平的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, S13處理組異育銀鯽增重率及特定生長率顯著高于其他各組, 各處理組的魚體粗蛋白含量無顯著差異, 粗脂肪隨飼料淀粉水平的升高呈先上升后下降的趨勢, S13處理組魚體粗脂肪含量最高, 顯著高于其他各組(P＜0.05)。在越冬期(2016年12月04日至2017年3月23日, 第114至第223天, D223), 不同處理組異育銀鯽增重率、特定生長率及肥滿度隨飼料淀粉水平升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 其中S13處理組異育銀鯽增重率及肥滿度顯著高于其他各組(P＜0.05), S3和S13處理組特定生長率顯著高于S23、S33和S43處理組(P＜0.05), 各處理異育銀鯽魚體粗蛋白和粗脂肪均無顯著差異。在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日, 第224至第275天, D275), 各處理組異育銀鯽增重率和特定生長率隨飼料淀粉水平升高呈現(xiàn)上升趨勢, S23、S33和S43處理組增重率顯著高于S3及S13處理組(P＜0.05), 各處理組飼料效率無顯著差異。各處理組異育銀鯽魚體蛋白及魚體脂肪無顯著性差異。在養(yǎng)成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天,D340), 異育銀鯽增重率及特定生長率隨飼料碳水化合物水平的升高呈先上升后下降的趨勢且S33處理組顯著高于其他各處理組(P＜0.05), 各處理組飼料效率無顯著差異。異育銀鯽各處理組魚體粗脂肪含量無顯著差異, 魚體蛋白含量隨飼料淀粉水平的升高呈先上升后下降趨勢, S33處理組最高(表 3和表 4)。

2.2 飼料淀粉對全養(yǎng)殖周期異育銀鯽魚“中科3號”后腸淀粉酶活性的影響

在幼魚期(2016年8月18日至2016年10月17日,第1至第63天, D63), 各處理組異育銀鯽后腸淀粉酶活性無顯著差異。在養(yǎng)成前期(2016年10月18日至2016年12月03日, 第64至第110天, D110), S3、S13和S23處理組異育銀鯽后腸淀粉酶活性無顯著差異, S43處理組后腸淀粉酶活性顯著高于S33處理組(P＜0.05)。在越冬期(2016年12月04日至2017年3月23日, 第114至第223天, D223), 不同處理組異育銀鯽后腸淀粉酶活性隨飼料淀粉水平升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, S23處理組后腸淀粉酶活性最高。在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日,第224至第275天, D275), 異育銀鯽后腸淀粉酶活性隨飼料淀粉水平的升高呈下降趨勢, 在養(yǎng)成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天, D340), 異育銀鯽后腸淀粉酶活性隨飼料淀粉水平的升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。魚體后腸淀粉酶活性在實(shí)驗(yàn)養(yǎng)成前期后高于幼魚期(圖 1)。

表 3 飼料淀粉水平對異育銀鯽“中科3號”生長性能的影響Tab. 3 Effects of dietary starch on growth performance of gibel carp

表 4 飼料淀粉水平對異育銀鯽魚體基本組分的影響(% 濕重)Tab. 4 Effects of dietary starch on body composition of gibel carp(% wet weight)

2.3 飼料淀粉對全養(yǎng)殖周期異育銀鯽魚“中科3號”血漿葡萄糖和血漿膽固醇的影響

在幼魚期(2016年8月18日至2016年10月17日,第1至第63天, D63), 魚體血漿葡萄糖濃度隨飼料淀粉水平升高呈先上升后不變的趨勢, 飼料碳水化合物水平高于23%處理組的異育銀鯽血漿葡萄糖濃度顯著高于飼料淀粉水平低于23%處理組(P＜0.05),異育銀鯽血漿膽固醇濃度無顯著差異。在養(yǎng)成前期(2016年10月18日至2016年12月03日, 第64至第110天, D110), 各處理組異育銀鯽血漿葡萄糖及血漿膽固醇含量無顯著差異。在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日, 第224至第275天, D275), 異育銀鯽血漿葡萄糖濃度隨淀粉水平的升高呈先上升后下降趨勢, S23處理組異育銀鯽血漿葡萄糖濃度最高, 各處理組血漿膽固醇濃度無顯著差異。在養(yǎng)成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天, D340), 各處理組異育銀鯽血漿葡萄糖濃度無顯著差異, 血漿膽固醇濃度隨飼料淀粉的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, S23處理組血漿膽固醇濃度最高(圖 2)。

2.4 飼料淀粉對全養(yǎng)殖周期異育銀鯽魚“中科3號”肝/肌糖原的影響

在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日,第224至第275天, D275), 各處理組肝糖原無顯著差異, S43處理組肌糖原含量最高, 顯著高于S33處理組(P＜0.05)。在養(yǎng)成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天, D340), 各處理組異育銀鯽肝和肌糖原含量無顯著差異(圖 3)。

2.5 飼料淀粉對全養(yǎng)殖周期異育銀鯽魚“中科3號”糖代謝基因表達(dá)的影響

在實(shí)驗(yàn)幼魚期(2016年8月18日至2016年10月17日, 第1至第63天, D63), 異育銀鯽肝臟glut2、hk和pepckmRNA的相對表達(dá)量隨飼料淀粉水平增加呈現(xiàn)上升趨勢,g6pcmRNA相對表達(dá)量隨飼料淀粉水平上升呈下降趨勢, 但各處理組間無顯著性差異。S43處理組異育銀鯽gkmRNA相對表達(dá)量顯著高于S3和S23處理組(P＜0.05)。在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日, 第224至第275天,D275), 各處理組異育銀鯽hk和g6pcmRNA相對表達(dá)量無顯著差異,glut2、gk和pepckmRNA相對表達(dá)量隨飼料淀粉水平的升高呈上升趨勢, S43處理組顯著高于其他各組(P＜0.05)。在養(yǎng)成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天, D340), 異育銀glut2、hk及gkmRNA相對表達(dá)量隨飼料淀粉水平的升高呈現(xiàn)上升趨勢, S43處理組相對表達(dá)量水平顯著高于其他各處理組(P＜0.05),各處理組異育銀鯽pepck相對表達(dá)量水平無顯著差異, 隨飼料淀粉水平的升高呈下降趨勢, 但各處理組差異不顯著(圖 4)。

3 討論

對魚類利用碳水化合物能力較低機(jī)制的探究主要圍繞2個(gè)方面, 一是消化道長短程度及淀粉酶分泌量較少; 二是胰島素和糖代謝酶不能產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)[19,20]。魚類生長、生理狀況、環(huán)境溫度和溶氧等均對碳水化合物的利用能力和機(jī)制產(chǎn)生一定的影響。

3.1 飼料淀粉對全養(yǎng)殖周期異育銀鯽魚“中科3號”后腸淀粉酶活性的影響

魚類淀粉酶主要分布于腸道組織, 后腸淀粉酶活性最高。有研究表明, 多種魚類糖酶活性隨魚類生長波動(dòng)較大, 淀粉酶活性隨魚體生長呈階段性上升趨勢且會(huì)出現(xiàn)一個(gè)峰值[21—26]。本實(shí)驗(yàn)研究也出現(xiàn)相似結(jié)果, 幼魚期D63異育銀鯽后腸淀粉酶活性水平較低且不隨飼料淀粉的變化而變化, 自養(yǎng)成前期D110之后異育銀鯽后腸淀粉酶活性及敏感度顯著增強(qiáng)。

3.2 飼料淀粉對全養(yǎng)殖周期異育銀鯽魚“中科3號”糖代謝酶活性及基因表達(dá)的影響

魚類攝食含淀粉飼料后血糖濃度升高, 糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)入組織中進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量循環(huán)[27,28]。肝臟是魚體進(jìn)行糖代謝的主要器官, 糖代謝過程主要包括糖酵解和糖異生, 葡萄糖經(jīng)過己糖激酶(HK)、葡萄糖激酶(GK)、6-磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)等糖酵解關(guān)鍵酶的作用轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)從而轉(zhuǎn)化為脂肪, 脂肪經(jīng)過三羧酸循環(huán)形成的丙酮酸也可通過丙酮酸羧化酶(PCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)、果糖-1, 6-二磷酸酶(FBPase)和葡糖-6-磷酸酶(G6PC)等糖異生關(guān)鍵酶的作用重新合成葡萄糖[29—32]。幼魚期D63異育銀鯽glut2 mRNA相對表達(dá)量無顯著差異, 其他階段異育銀鯽glut2 mRNA相對表達(dá)量水平隨飼料淀粉水平升高而升高。各生長階段異育銀鯽糖酵解的敏感度高于糖異生代謝。

圖 1 飼喂不同淀粉水平飼料后異育銀鯽后腸淀粉酶活性的變化Fig. 1 Amylase activities in hindgut of gibel carp fed with different starch diets

圖 2 飼喂不同碳水化合物水平飼料異育銀鯽血糖濃度(A)和血漿膽固醇(B)濃度變化Fig. 2 Plasma glucose (A) and cholesterol (B) of gibel carp fed with different starch diets

圖 3 飼喂不同淀粉水平飼料后異育銀鯽肝糖原(A)和肌糖原(B)的變化Fig. 3 The levels of hepatic glycogen (A) and muscle glycogen (B) in gibel carp fed with different starch diets

圖 4 飼喂不同淀粉水平飼料后異育銀鯽肝臟糖代謝相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的變化Fig. 4 Relative expression of hepatic glucose metabolism related genes of gibel carp fed with different starch diets

3.3 全養(yǎng)殖周期異育銀鯽魚“中科3號”的糖需求

對于魚類全養(yǎng)殖周期不同階段糖需求及糖代謝差異的整體研究非常少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同生長階段異育銀鯽對飼料淀粉的需求差異較大, 越冬后異育銀鯽糖利用能力顯著高于越冬前。其中幼魚期D63異育銀鯽適宜飼料碳水化合物水平為23%; 養(yǎng)成前期D110異育銀鯽適宜飼料淀粉水平減為13%。越冬后D275組異育銀鯽整體代謝旺盛,43%淀粉組生長最好; 而養(yǎng)成中后期D340異育銀鯽飼料淀粉需求則再次降到33%。

在本研究中, 異育銀鯽越冬階段沒有投喂飼料,魚體沒有出現(xiàn)體重降低的現(xiàn)象是由于本實(shí)驗(yàn)在長江故道江段上進(jìn)行, 而異育銀鯽是雜食性魚類, 在越冬期攝食了水體中藻類等生物性餌料, 所以沒有表現(xiàn)出越冬期體重下降, 此結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室前期在相同地點(diǎn)的異育銀鯽越冬期生長結(jié)果相一致[33]。越冬期異育銀鯽生長表現(xiàn)變化趨勢與養(yǎng)成前期變化趨勢相一致, 和越冬前生長較好的魚體在攝食上占有優(yōu)勢緊密相關(guān), 進(jìn)而在越冬期間表現(xiàn)出一致的生長優(yōu)勢。

綜上所述, 幼魚期異育銀鯽可能由于魚體代謝系統(tǒng)發(fā)育不完善, 腸道淀粉酶活性及糖代謝各環(huán)節(jié)對飼料淀粉水平變化應(yīng)答不敏感進(jìn)而導(dǎo)致利用飼料淀粉的能力較弱, S23處理組生長表現(xiàn)最好。養(yǎng)成前期異育銀鯽機(jī)體功能更為完善, 糖代謝應(yīng)答機(jī)制敏感, 其糖利用能力依然不強(qiáng)可能是由于季節(jié)變化帶來的環(huán)境脅迫所致。幼魚期和養(yǎng)成前期魚體生長表現(xiàn)和脂肪積累趨勢相一致, 推測是這一階段魚體生長快速所致。越冬后階段異育銀鯽由于生長代償作用, 異育銀鯽整體代謝水平較高, 糖代謝應(yīng)答機(jī)制敏感且糖利用能力較強(qiáng), S43處理組生長表現(xiàn)最好。在養(yǎng)成中后期異育銀鯽魚體機(jī)能趨近完善, 對飼料碳水化合物的利用能力較高, 其生長性能和蛋白積累趨勢相一致均在S33處理組表現(xiàn)最好, 暗示淀粉通過其他途徑產(chǎn)生了蛋白節(jié)約的作用。異育銀鯽生長各階段糖酵解調(diào)節(jié)機(jī)制敏感, 糖異生調(diào)節(jié)不敏感, 其具體原因有待進(jìn)一步探究。