邢露梅 肖 偉, 李蘭蘭 張利平 賽清云, 俞兆曦, 吳旭東 * 連總強(qiáng) *

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所(有限公司), 銀川 750001;3. 寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心, 銀川 750001; 4. 寧夏漁業(yè)科技院士工作站, 銀川 750001)

蘭州鲇(Silurus lanzhouensisChen)俗稱(chēng)黃河鯰[1],是黃河中上游特有的重點(diǎn)保護(hù)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi), 具有刺少、肉多和味美的特點(diǎn), 富含多種人類(lèi)必需氨基酸,俗有“黃河鯰魚(yú)活人參”之美稱(chēng), 2014年被評(píng)為“黃河生物名片”, 具有重要的生態(tài)功能和廣闊的養(yǎng)殖前景[2,3]。近年來(lái)由于水利工程建設(shè)、生境破壞及過(guò)度捕撈等原因, 蘭州鲇野生種群數(shù)量逐年下降,被《中國(guó)物種紅色名錄》列為瀕危物種[4], 有效保護(hù)和科學(xué)利用這一重要生態(tài)位重點(diǎn)保護(hù)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源成為黃河生態(tài)文明建設(shè)的重要內(nèi)容之一。目前已開(kāi)展野生馴養(yǎng)和人工繁育等試驗(yàn)研究及定期增殖放流等保種救護(hù)工作[2,3,5], 但傳統(tǒng)活體保種中面臨著可能產(chǎn)生的世代間隔、基因丟失和遺傳漂變等常見(jiàn)問(wèn)題。

超低溫冷凍保存技術(shù)是動(dòng)植物種質(zhì)資源保護(hù)最直接有效的方法之一[6], 目前魚(yú)類(lèi)遺傳材料保存相關(guān)領(lǐng)域的研究主要集中在魚(yú)類(lèi)精子凍存與復(fù)蘇等方面[7], 迄今已相繼建立200多種魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存技術(shù)[8], 斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)[9]、藍(lán)鯰(Ictalurus furcatus)[10]及黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)[11]等多種魚(yú)類(lèi)精子超低溫冷凍保存技術(shù)已用于實(shí)際生產(chǎn)。但由于不同魚(yú)類(lèi)其精子結(jié)構(gòu)、滲透壓、pH及精漿成分等生理特性差異, 很難找到一種通用方法[12], 目前尚未見(jiàn)蘭州鲇精子冷凍保存相關(guān)研究報(bào)道。為進(jìn)一步加強(qiáng)蘭州鲇這一瀕危特有經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)種質(zhì)救護(hù)、保種和可持續(xù)利用, 本文通過(guò)開(kāi)展蘭州鲇精液超低溫保存抗凍劑與凍存、解凍技術(shù)相關(guān)研究, 探討冷凍和解凍對(duì)精子的損傷機(jī)制,以期為蘭州鲇種質(zhì)資源保護(hù)和新品種開(kāi)發(fā)提供一定理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用蘭州鲇采自寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所國(guó)家級(jí)黃河鯰原種場(chǎng), 選擇健康體質(zhì)健壯且無(wú)病無(wú)傷的性成熟雄性親魚(yú), 魚(yú)用促黃體生成素釋放激素類(lèi)似物A2(LRH-A2)和地歐酮(DOM)注射(2.5 μg/kg LRH-A2+1.5 mg/kg DOM)催產(chǎn)12—16h后, 用指壓法采集精液, 鏡檢精子活力大于85%以上精液用本實(shí)驗(yàn)室自制保存液C液(檸檬酸鈉三鈉34 mmol/L、葡萄糖146.5 mmol/L、氯化鉀4 mmol/L、碳酸氫鈉23.80 mmol/L、青霉素80萬(wàn)IU/L和鏈霉素100萬(wàn)IU/L)稀釋8倍, 置于4℃培養(yǎng)箱冷藏備用。

1.2 抗凍劑篩選

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果, 分別設(shè)置二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)及甲醇(Methyl alcohol,MeOH)5%、10%、15%及20% 四個(gè)濃度組, 設(shè)置N,N-二甲基甲酰胺(N, N-Dimethylformamide, DMF)3%、5%、10%及15% 四個(gè)濃度組, 每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。吸取1 mL的精液保存液(稀釋精液添加抗凍劑)至細(xì)胞凍存管, 4℃平衡30min, –80℃平衡30min后迅速投入液氮中冷凍保存。24h后從液氮中快速取出凍存管, 置于37℃水浴搖晃解凍至冰晶剛?cè)诨? 立即吸取2.5 μL精液加10 μL去離子水(曝氣24h)混合進(jìn)行精子激活, 置于光學(xué)顯微鏡下測(cè)定精子激活率(激活后運(yùn)動(dòng)精子數(shù)量占全部精子數(shù)量的百分比), 每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3 程序凍存與解凍處理?xiàng)l件篩選

以1.2中篩選獲得的最佳抗凍劑及最佳濃度配制精液凍存液, 依次分別開(kāi)展凍存中4℃平衡時(shí)間、–80℃平衡時(shí)間和解凍溫度篩選等3個(gè)單因素分析試驗(yàn)。其中: 4℃平衡時(shí)間篩選設(shè)置0、10、20、30和40min五個(gè)處理組(n=3), 其他方法同1.2;固定篩選獲得的最優(yōu)4℃平衡時(shí)間條件, 設(shè)置0、15、30、45和60min5個(gè)處理組(n=3)進(jìn)行–80℃平衡時(shí)間條件篩選, 其他方法同1.2; 固定篩選獲得的最優(yōu)4℃和–80℃平衡時(shí)間條件, 設(shè)置27℃、32℃、37℃、40℃、42℃5個(gè)處理組(n=3)進(jìn)行適宜解凍溫度篩選, 其他方法同1.2。

1.4 凍存損傷檢測(cè)

以鮮精為對(duì)照, 采用3種方法進(jìn)行最佳程序凍存與解凍條件處理后精子凍存損傷檢測(cè)。對(duì)鄧爽等[13]單細(xì)胞凝膠電泳(Single-cell gel electrophoresis,SCGE)方法改進(jìn)后進(jìn)行核DNA損傷檢測(cè)(n=100),Nikon TE2000熒光顯微鏡于綠光激發(fā)光下觀察并拍攝彗星圖片。采用掃描電鏡(Scanning electron microscope, SEM)法和透射電鏡(Transmission electron microscopy, TEM)法[14]觀察凍精超微結(jié)構(gòu)損傷。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

彗星圖像用CASP軟件分析獲得尾部DNA含量百分比(DNA in Tail)、Olive尾距 (Olive tail moment, OTM)等比例參數(shù)評(píng)估精子DNA損傷(Sperm DNA fragmentation, SDF)。將蘭州鲇精子核DNA損傷程度按照彗星尾部DNA含量百分比分為5級(jí):G0級(jí)為＜5%, G1級(jí)為5%—20%, G2級(jí)為20%—40%,G3級(jí)為40%—95%, G4級(jí)為＞95%, 彗星率=(彗星細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目)×100; 損傷系數(shù)=[(G0級(jí)損傷的細(xì)胞個(gè)數(shù)×0)+(G1級(jí)損傷的細(xì)胞個(gè)數(shù)×1)+(G2級(jí)損傷的細(xì)胞個(gè)數(shù)×2)+(G3級(jí)損傷的細(xì)胞個(gè)數(shù)×3)+(G4級(jí)損傷的細(xì)胞個(gè)數(shù)×4)]。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Excel整理, 通過(guò)SPSS21.0軟件單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)各組精子活力的差異顯著性, 統(tǒng)計(jì)結(jié)果以Mean±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 抗凍劑種類(lèi)與濃度對(duì)精子冷凍保存效果的影響

不同抗凍劑對(duì)蘭州鲇精液冷凍保存試驗(yàn)表明(圖 1), 各組激活率與鮮精差異顯著(P≤0.05), 且3種抗凍劑對(duì)精子保護(hù)效果隨濃度增加呈先升后降的趨勢(shì)。DMF抗凍劑組中5% DMF凍精激活率(37.78±7.54)%顯著高于其他3個(gè)濃度(P≤0.05)。15% MeOH組凍精激活率為(36.67±3.53)%, 顯著高于MeOH抗凍劑組其他3個(gè)濃度組(P≤0.05)。DMSO抗凍劑組中10% DMSO對(duì)蘭州鲇精子保護(hù)效果最好, 激活率達(dá)(52.78±7.54)%, 顯著高于其他各組(P≤0.05)。5% DMF、5% DMSO、15% DMSO及15% MeoH組激活率相比無(wú)顯著差異(P＞0.05), 但顯著低于10% DMSO組(P≤0.05)。

2.2 4℃平衡時(shí)間對(duì)精子冷凍保存效果的影響

4℃平衡時(shí)間對(duì)蘭州鲇精子冷凍保存效果影響(圖 2A), 平衡時(shí)間20min時(shí)激活率最高, 達(dá)(69.44±8.45)%, 平衡10min與30min凍精激活率差異不顯著(P＞0.05), 但顯著低于20min組(P≤0.05), 平衡時(shí)間40min凍精激活率顯著低于10 min和30 min, 不平衡組凍精激活率最低, 為(11.11±4.86)%, 各組凍精激活率與鮮精相比均差異顯著(P≤0.05)。

2.3 –80℃平衡時(shí)間對(duì)精子冷凍保存效果的影響

蘭州鲇精子?80℃平衡時(shí)間為30min時(shí)激活率最高(圖 2B), 達(dá)(71.66±7.52)%, 其次是15min, 激活率為(54.16±8.61)%, 兩者之間差異顯著(P≤0.05),平衡時(shí)間45min與60min激活率差異不顯著(P＞0.05), 但顯著低于15min、30min組(P≤0.05), 未平衡組僅可見(jiàn)個(gè)別精子被激活, 凍精激活率為(0.33±0.52)%, 各組凍精激活率與鮮精相比差異均顯著(P≤0.05)。

圖 1 不同抗凍劑不同濃度對(duì)蘭州鲇精子超低溫冷凍保存效果的影響Fig. 1 Effects of different antifreeze agents on cryopreservation of spermatozoon in S. lanzhouensis

2.4 解凍溫度對(duì)精子冷凍保存效果的影響

解凍溫度對(duì)蘭州鲇精子冷凍保存影響(圖 2C),隨解凍溫度升高精子激活率呈先升后降趨勢(shì), 40℃組凍精激活率(75.56±3.91)%最大, 顯著高于27℃、32℃和37℃組(P≤0.05), 與42℃組凍精激活率(68.89±3.33)%差異不顯著(P＞0.05); 32℃、37℃和42℃組凍精激活率差異不顯著(P＞0.05), 27℃組凍精激活率顯著低于其他組(P≤0.05), 各組凍精激活率與鮮精相比差異均顯著(P≤0.05)。

2.5 蘭州鲇鮮精及凍精核DNA損傷SCGE檢測(cè)

如圖 2D所示, 10月份采集鮮精激活率相較于7月份顯著降低(P≤0.05), 與7月份凍精激活率相當(dāng)(P＞0.05); 10月份凍精與7月份凍精差異顯著(P≤0.05)。10月份采集蘭州鲇精液用最優(yōu)組凍存方法凍存1個(gè)月, 鮮精及凍存10d、20d、30d凍精進(jìn)行SCGE檢測(cè), 將精子分為5級(jí): G0級(jí)精子正常的非彗星樣細(xì)胞, 精子核完整(圖 3A); G1級(jí)精子核縮小可見(jiàn)慧尾, 輕度損傷(圖 3B); G2級(jí)精子核進(jìn)一步縮小,彗尾明顯延長(zhǎng), 中度損傷(圖 3C); G3級(jí)精子屬于重度損傷, 精子核明顯縮小, 彗尾較長(zhǎng)(圖 3D), 未見(jiàn)G4級(jí)完全損傷精子, 計(jì)算各級(jí)別精子占精子總數(shù)百分比, 同時(shí)統(tǒng)計(jì)彗星率和損傷系數(shù)。結(jié)果如表 1所示, 凍精與鮮精相比G0級(jí)精子差異顯著(P≤0.05),G1、G2和G3級(jí)精子增多但無(wú)顯著差異, 10d、20d和30d凍精各級(jí)精子差異均不顯著(P＞0.05), 鮮精彗星率、損傷系數(shù)與凍精有顯著差異(P≤0.05),但各凍存組之間差異不顯著(P＞0.05)。

2.6 蘭州鲇精子凍存形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)損傷分析

應(yīng)用掃描電鏡檢測(cè)法進(jìn)行蘭州鲇精子凍存形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷分析, 結(jié)果表明: 鮮精中27%精子形態(tài)結(jié)構(gòu)異常, 凍精中47.4%精子形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。蘭州鲇正常精子結(jié)構(gòu)屬于鞭毛型, 由頭部、中段和尾部組成, 無(wú)側(cè)鰭, 頭部圓球形, 直徑約(1.57±0.08) μm, 中段明顯, 呈袖套狀, 長(zhǎng)徑約(1.23±0.12) μm, 短經(jīng)約(0.52±0.12) μm, 尾部鞭毛細(xì)長(zhǎng)約(41.92±3.39) μm, 核膜與質(zhì)膜平滑完整(圖 4A)。凍存對(duì)蘭州鲇精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷主要表現(xiàn)為: 凍存損傷精子整體未發(fā)生膨脹, 但存在頭部細(xì)胞膜出現(xiàn)破損(圖 4B和4C)、皺縮凹陷變形(圖 4D)、中段袖套結(jié)構(gòu)破裂、線(xiàn)粒體脫落(圖 4B)和尾部鞭毛發(fā)生斷裂(圖 4B)的情況。

應(yīng)用透射電鏡檢測(cè)法進(jìn)一步分析凍存對(duì)蘭州鲇精子超微結(jié)構(gòu)損傷情況, 結(jié)果表明: 正常蘭州鲇精子頭部主要由細(xì)胞核構(gòu)成, 外部可見(jiàn)清晰質(zhì)膜包裹, 前端無(wú)頂體或類(lèi)似頂體膜結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核與質(zhì)膜之間空隙含有極少細(xì)胞質(zhì), 無(wú)其他細(xì)胞器(圖 5A和5B)。核內(nèi)染色質(zhì)致密, 核空泡位置、形狀和大小不定, 頭部后端有一植入窩, 含有由近端中心粒和基體(又稱(chēng)遠(yuǎn)端中心粒)兩部分組成中心粒復(fù)合體,近端中心粒緊貼核膜, 近端與遠(yuǎn)端中心粒處于同一直線(xiàn), 且其長(zhǎng)軸相互垂直, 呈“T”形(圖 5A)。中段袖套結(jié)構(gòu)緊連頭部尾端, 圍繞尾端軸絲近似對(duì)稱(chēng)分布,富含線(xiàn)粒體, 線(xiàn)粒體及其他細(xì)胞器分層排列(圖 5C)。袖套與軸絲之間空腔為袖套腔。尾部(鞭毛)發(fā)生于基體, 尾部的橫切面呈卵圓形(圖 5D), 直徑0.26—0.30 μm, 由軸絲及附屬纖維構(gòu)成, 軸絲由9組外周纖維和2條中央纖維組典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu), 無(wú)側(cè)鰭(圖 5D)。凍存后部分精子超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的損傷, 主要表現(xiàn)為膜損傷, 細(xì)胞質(zhì)與染色質(zhì)膜發(fā)生破損、折皺、囊泡化或整體脫落(圖 5E和5F), 細(xì)胞核與質(zhì)膜空隙加大, 核質(zhì)疏散(圖 5E和5G), 線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)彌散, 線(xiàn)粒體內(nèi)容物外流(圖 5E和5G), 中心粒復(fù)合體發(fā)生易位(圖 5E), 鞭毛外膜變形脫離, 發(fā)生斷裂(圖 5H), 微管結(jié)構(gòu)基本完好(圖 5I)。

圖 2 不同平衡時(shí)間、解凍溫度及采集時(shí)間對(duì)蘭州鲇精液激活率的影響Fig. 2 Effects of different equilibrium time defrost temperature and collection time on semen activation rate of S. lanzhouensis

圖 3 精子單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)圖Fig. 3 Comet image of spermatozoon

3 討論

3.1 抗凍劑種類(lèi)及濃度對(duì)精子活力的影響

隨著水產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展以及種質(zhì)資源保存、雜交育種和新品種選育等工作的開(kāi)展, 魚(yú)類(lèi)精液超低溫保存技術(shù)研發(fā)與應(yīng)用越來(lái)越廣泛。超低溫保存中通過(guò)添加適宜抗凍劑可降低細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃度,減少冰晶損傷, 從而大大提高了保存效果, 延長(zhǎng)了保存時(shí)間。但魚(yú)類(lèi)精子具有種屬特異性, 同種抗凍劑對(duì)于不同魚(yú)類(lèi)精子滲透性和毒性不同, DMSO、DMF及MeOH是3種淡水魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存常見(jiàn)的滲透性?xún)龃鎰MSO具有高滲透性, 易和精子膜上磷脂層相互作用, 是目前使用最多的魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存抗凍劑之一, 同時(shí)DMSO滲入致使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓相差太大, 精子細(xì)胞可能發(fā)生潰解[15], 產(chǎn)生毒性。在鯔(Mugil cephalusLinnaeus)[16]、虹鱒(Oncorhynchus mykissWalbaum)[17]、中國(guó)花鱸(LateolabraxjaponicusMcClelland)[18]及Nandus nandus(Hamilton, 1822)[19]等多種魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存中,DMSO濃度為8%—12%時(shí)對(duì)凍精保護(hù)作用最好, 且對(duì)精子毒性存在劑量依賴(lài)性。本研究DMSO對(duì)蘭州鲇凍精保護(hù)效果高于DMF和MeOH, 10% DMSO效果最好, 且隨著濃度增加凍精激活率遞減, 這一結(jié)果與前述研究結(jié)論一致。相對(duì)而言DMF和MeOH對(duì)蘭州鲇凍精保護(hù)效果不及DMSO, 與姜仁良等[20]研究發(fā)現(xiàn)13% DMF超低溫凍存團(tuán)頭魴、鯉、草魚(yú)及鰱精液受精率高于13%DMSO的結(jié)果相悖, 亦與劉光霞等[8]發(fā)現(xiàn)圓口銅魚(yú)(Coreius guichenotiSauyage et Dabry)精子超低溫凍存研究中10% MeOH凍精活力高于DMF和DMSO的研究結(jié)果相悖, 可能原因是精子自身適應(yīng)能力不同和對(duì)抗凍劑滲透性不同, 造成DMF和MeOH不適于蘭州鲇精液保存。

表 1 蘭州鲇凍精SCGE檢測(cè)的DNA損傷分級(jí)Tab. 1 DNA damage of frozen semen of S. lanzhouensis by SCGE

圖 4 蘭州鲇精子凍存損傷掃描電鏡觀察Fig. 4 The ultrastructure of fresh and cryopreserved spermatozoon atozoa of S. lanzhouensis by SEM

3.2 冷凍程序?qū)踊盍Φ挠绊?/h3>

4℃平衡一段時(shí)間有利于精子超低溫凍存時(shí)凍存劑充分滲透進(jìn)精子細(xì)胞降低冰晶損傷, 但隨平衡時(shí)間增長(zhǎng)抗凍劑對(duì)精子細(xì)胞毒性作用也會(huì)增強(qiáng), 適宜的平衡時(shí)間有利于抗凍劑對(duì)精子起到良好保護(hù)作用。同類(lèi)抗凍劑對(duì)不同魚(yú)類(lèi)精子滲透性不同, 不同魚(yú)類(lèi)4℃平衡時(shí)間也不同。黃顙魚(yú)[11]、北梭子魚(yú)(Esox lucius)[21]及匙吻鱘(Polyodon spathula)[22]等魚(yú)類(lèi)4℃平衡10—15min對(duì)精子有良好保護(hù)效果, 圓口銅魚(yú)[8]4℃平衡25min后冷凍保存效果較好, 而光唇魚(yú)(Acrossocheilus fasciatus)[23]精子4℃下平衡30min有較好的冷凍保存效果。本研究中4℃處理20min為蘭州鲇精子適宜的冷凍保存前平衡時(shí)間。

超低溫冷凍保存過(guò)程中降溫速率太快, 精子細(xì)胞中水分來(lái)不及滲出易形成冰晶, 損傷精子細(xì)胞器及細(xì)胞膜, 造成精子運(yùn)動(dòng)速率下降及死亡。于–80℃平衡過(guò)渡可降低精子因直接放入–196℃液氮形成冰晶造成精子損傷及死亡。Nahiduzzaman等[24]將藍(lán)黑鯪(Labeo calbasuHamilton)精子以程序降溫法從5℃降到–80℃超低溫保存, 凍精激活率為75%。丁淑艷等[25]將興國(guó)紅鯉(Cyprinus carpio var singuonensis)精子于–80℃平衡15min后保存至液氮中, 解凍后精子活力達(dá)83%。本研究中蘭州鲇精液于–80℃平衡30min, 冷凍效果效果最好, 直接投入液氮凍精幾乎全部死亡, 這一結(jié)果與前述結(jié)論相符。

解凍是冷凍的逆過(guò)程, 損傷機(jī)制與冷凍損傷類(lèi)似, 解凍過(guò)程滲透壓變化造成精子細(xì)胞器損傷, 進(jìn)而影響精子成活率[8]。不同魚(yú)類(lèi)凍精的解凍溫度因冷凍工藝不同而異, 精子冷凍保存速率越快, 解凍溫度越高, 常用的解凍溫度是30—40℃水浴解凍,適宜的解凍溫度可以使精子度過(guò)損傷敏感區(qū)[23]。在本研究中, 40℃水浴解凍蘭州鲇精子活力較佳,溫度過(guò)高過(guò)低都會(huì)影響精子活力, Muthmainnah等[26]在39—40℃水浴解凍縱帶紋唇魚(yú)(Osteochilus vit-tatusValenciennes)凍精, 史應(yīng)學(xué)等[18]在40℃水浴中解凍中國(guó)花鱸凍精, 37℃水浴解凍斑鱖(Siniperca scherzeriSteindachner)精子獲得了較高精子成活率[12]。

圖 5 蘭州鲇鮮精及凍精透射電鏡觀察Fig. 5 The ultrastructure of fresh and cryopreserved spermatozoon atozoa of S. lanzhouensis by TEM

3.3 凍精與鮮精核損傷檢測(cè)

精子DNA損傷情況是檢測(cè)精子質(zhì)量的一個(gè)重要依據(jù)。Miskolczi等[27]研究證明冷凍損傷精子基因組在受精過(guò)程中不參與胚胎發(fā)育, 致使非洲鲇形成單倍體個(gè)體。單細(xì)胞凝膠電泳是一種檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷的經(jīng)典方法, 具有靈敏度高、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和快速等各種優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞通過(guò)裂解和DNA解鏈等過(guò)程, 經(jīng)電泳使損傷的DNA從細(xì)胞核中溢出, 向陽(yáng)極泳動(dòng), 形成尾狀帶, 即彗尾, 未損傷的DNA部分保持球形, 兩者共同形成“彗星”[28,29]。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按照徐西長(zhǎng)等[30]的方法進(jìn)行多次單細(xì)胞凝膠電泳, 最后都未跑出彗星圖, 而按照鄧爽等方法得到清晰彗星圖像, 可用于蘭州鲇精子DNA損傷檢測(cè)。

SCGE檢測(cè)的蘭州鲇精子于10月9日采集, 此時(shí)已錯(cuò)過(guò)繁殖期, 鮮精活力只有79%, 顯著低于7月份96%, 且精子超低溫凍存損傷程度明顯高于7月份精子。該研究結(jié)果與Pérez-Cerezales等[31]研究虹鱒不同季節(jié)精子DNA碎片率發(fā)現(xiàn)的精子冷凍前差異更容易受到低溫?fù)p傷結(jié)果一致。因此凍精DNA損傷可能由冷凍工藝和精子冷凍前差異兩個(gè)原因造成, 所測(cè)得彗星率與損傷系數(shù)會(huì)較7月份凍精高。一般認(rèn)為, 精子在液氮(–196℃)中處于休眠狀態(tài), 保存時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)精子質(zhì)量無(wú)顯著影響。史應(yīng)學(xué)等[32]發(fā)現(xiàn), 中國(guó)花鱸精子超低溫凍存30d后活力無(wú)顯著差異, 陳松林等[33]用塑料管法長(zhǎng)期保存(1年)與短期保存的鯉、草魚(yú)和鰱凍精激活率均在70%左右。周磊等[12]將斑鱖精子液氮保存2—30d的激活率、雜交受精率和孵化率均無(wú)顯著差異。本實(shí)驗(yàn)蘭州鲇精子超低溫凍存10—30d激活率、DNA損傷彗星率和損傷系數(shù)無(wú)顯著差異, 結(jié)合相關(guān)研究推測(cè)精液在液氮中保存時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)凍精影響不大, 但仍需在后續(xù)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 鮮精及凍精超微結(jié)構(gòu)

硬骨魚(yú)類(lèi)精子主要由頭部, 中段和尾部組成,細(xì)胞核為頭部主要結(jié)構(gòu), 中段由中心粒復(fù)合體和袖套構(gòu)成, 尾部鞭毛是其主要運(yùn)動(dòng)器官。多種魚(yú)類(lèi)研究表明, 普通形態(tài)學(xué)與精子超微結(jié)構(gòu)結(jié)合運(yùn)用于魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育分析為物種分類(lèi)提供依據(jù), 同一科或亞科的魚(yú)類(lèi)精子結(jié)構(gòu)分布模式有很高的相似性, 存在系統(tǒng)發(fā)生的聯(lián)系[34,35]。掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)蘭州鲇精子可明顯分為頭部、中段和尾部, 與索氏六須鲇(Silurus soldatovi)[36]和南方鲇(SilurusmeridionalisChen)[37]等鲇科魚(yú)類(lèi)相同。蘭州鲇球形或橢圓形的精子頭部形態(tài)與索氏六須鲇[36]、南方鲇[37]和鲇(Silurus asotus)[38]相似, 主要由細(xì)胞核構(gòu)成, 核質(zhì)致密。頭部后端有一植入窩含有中心粒復(fù)合體, 中心粒軸絲相互垂直呈“T”形, 遠(yuǎn)端中心粒向外延伸出尾部軸絲。中段由袖套及中心粒復(fù)合體組成, 接連細(xì)胞核后端。尾部與南方鲇[37]、鲇[38]和埃及尼羅河鲇[39]等大多數(shù)鲇形目魚(yú)類(lèi)一樣, 具單鞭毛和無(wú)側(cè)鰭, 不同于棘甲鯰科的韋氏上棘鮠和鈍囊鯰屬魚(yú)類(lèi)的雙鞭毛[40]及黃顙精子單鞭毛的兩排側(cè)鰭[41]。本研究通過(guò)超微形態(tài)結(jié)構(gòu)分析, 發(fā)現(xiàn)超低溫凍存解凍主要造成蘭州鲇精子膜、線(xiàn)粒體和鞭毛損傷, 同大多數(shù)硬骨魚(yú)類(lèi)精子超低溫凍存損傷一樣主要為機(jī)械損傷。張雪雷等[42]研究發(fā)現(xiàn)大菱鲆超低溫凍存損傷中60%—70%精子為膜損傷, 而膜損傷主要包括結(jié)構(gòu)損傷和化學(xué)損傷[43]。結(jié)構(gòu)損傷主要由于降溫過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)水分未完全脫出形成冰晶,損傷膜蛋白及脂類(lèi)?；瘜W(xué)損傷則主要因冷凍過(guò)程中細(xì)胞外物質(zhì)先結(jié)冰、細(xì)胞內(nèi)發(fā)生脫水、pH與離子濃度等細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化及大分子復(fù)合物解體, 造成膜結(jié)構(gòu)破損、折皺、囊泡化或整體脫落等不可逆損傷[42,44]。本研究中蘭州鲇凍精發(fā)生的細(xì)胞質(zhì)膜和染色質(zhì)膜破損、折皺、囊泡化或整體脫落, 細(xì)胞核與質(zhì)膜空隙加大等超微結(jié)構(gòu)變化證實(shí)了這一觀點(diǎn)。鞭毛是精子運(yùn)動(dòng)胞器, 袖套內(nèi)線(xiàn)粒體則為精子運(yùn)動(dòng)的供能場(chǎng)所。中國(guó)大鯢(Andrias davidianus)[45]凍精超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體嵴變形、軸絲彎曲和質(zhì)膜膨脹等直接導(dǎo)致凍精活力和復(fù)蘇率下降。本研究中凍精線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)損傷、中心粒復(fù)合體易位和鞭毛外膜變形脫離同樣也嚴(yán)重影響鞭毛運(yùn)動(dòng)性能, 引起精子活力和受精率下降。本研究中鞭毛微管結(jié)構(gòu)未發(fā)生損傷, 但鞭毛與中段連接處發(fā)生斷裂, 這是因?yàn)楸廾c中段2種不同的胞骨架連接處結(jié)構(gòu)脆弱, 造成脫節(jié), 與西伯利亞鱘(Acipenser b.baerii)[43]損傷結(jié)果一致。