李蘭蘭 邢露梅 俞兆曦, 肖 偉, 賽清云, 劉彥斌, 田永華,王 燕,劉 哲連總強(qiáng),*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所(有限公司), 銀川 750001;3. 寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心, 銀川 750001; 4. 寧夏漁業(yè)科技院士工作站, 銀川 750001)

蘭州鲇(Silurus lanzhouensis)又名黃河鯰, 隸屬于鲇形目(Siluriformes)鲇科(Siluridea)鲇屬(Silurus)[1], 為我國黃河中上游特有的大型土著魚類, 2004年已被《中國物種紅色名錄》列為瀕危物種[2]。2007年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)建立寧夏衛(wèi)寧段蘭州鲇國家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū), 2014年蘭州鲇被評(píng)為黃河生物名片[3]。近些年寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所已先后攻克了蘭州鲇人工繁育等技術(shù)難題, 成為目前國內(nèi)最大的保種救護(hù)繁育基地, 每年向黃河增殖放流大規(guī)格苗種50萬尾以上, 在一定程度上恢復(fù)了這一瀕危魚類種質(zhì)資源, 但同時(shí)也面臨著因多年累代繁育引起的種質(zhì)退化問題。針對(duì)近些年產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、市場(chǎng)需求度較大和養(yǎng)殖戶積極性較高的實(shí)際需求, 課題組也在加快蘭州鲇良種新品種的選育工作[4,5], 但以往家系選育中采用不同家系不同池塘或不同網(wǎng)箱培育選擇, 面臨環(huán)境差異、基礎(chǔ)設(shè)施投入及管理力度加大等問題; 采用電子標(biāo)記進(jìn)行家系個(gè)體標(biāo)記存在幼體無法標(biāo)記、標(biāo)記易脫落、標(biāo)記昂貴和標(biāo)記費(fèi)時(shí)費(fèi)力等困難。因此, 建立有效的親子鑒定及系譜管理技術(shù)是開展蘭州鲇種質(zhì)資源救護(hù)保存和良種新品種選育中避免近交衰退的急需關(guān)鍵技術(shù)手段。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展, 微衛(wèi)星(Microsatellites)以其廣泛分布于基因組中, 遵循孟德爾共顯性遺傳定律, 多態(tài)性高且易于PCR擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)[6]被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)生物家系系譜關(guān)系管理等方面。多重PCR(Multiplex PCR)首次由Chamberlian等[7]提出,因其可大大降低因大量樣品重復(fù)處理帶來的人為誤差, 且較分批次單個(gè)PCR更加高效、便捷和經(jīng)濟(jì),目前被廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)和動(dòng)植物研究中, 尤其是為大樣本量水生生物親緣關(guān)系分析[8]、群體遺傳多樣性分析[9]、遺傳分離模式分析[10]和種質(zhì)鑒定[11]等研究提供了有力的技術(shù)手段?；诖? 本研究開展蘭州鲇微衛(wèi)星多重PCR體系構(gòu)建并建立可靠的親子鑒定技術(shù), 以期為今后開展蘭州鲇家系良種選育、種質(zhì)系譜管理及資源救護(hù)繁育等方面工作提供有力技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年6—8月在寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所國家級(jí)黃河鯰原種場(chǎng)進(jìn)行, 隨機(jī)選取2018年建立的3個(gè)家系, 編號(hào)為7-1、8-8和8-11, 每個(gè)家系隨機(jī)選取30尾子代, 候選親本樣本由6尾真正親本和14尾(雌、雄各7尾)非親本組成, 另從7-1中隨機(jī)選取18尾, 8-8和8-11中隨機(jī)各選取16尾共50尾子代用于雙盲實(shí)驗(yàn)。此外, 隨機(jī)選取16尾蘭州鲇養(yǎng)殖群體用于構(gòu)建蘭州鲇微衛(wèi)星多重PCR體系。所有樣本均采集尾鰭組織, 用75%乙醇固定后置于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

基因組DNA提取蘭州鲇樣本基因組DNA的提取參考楊忠禮等[12]改進(jìn)的酚-氯仿法結(jié)合DNA產(chǎn)物純化試劑盒法, 超微量核酸分析儀檢測(cè)濃度及OD值, 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。將合格的DNA用ddH2O稀釋至50 ng/μL, ?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

微衛(wèi)星多重PCR引物篩選及優(yōu)化根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性、序列重復(fù)單位及擴(kuò)增效果等,從已開發(fā)的蘭州鲇微衛(wèi)星[13,14]中篩選出18個(gè)位點(diǎn)。將每對(duì)引物信息通過Multiplex Manager1.0[15]軟件模擬檢測(cè), 避免產(chǎn)生錯(cuò)配、引物二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)等, 先進(jìn)行2個(gè)位點(diǎn)之間組合, 然后在擴(kuò)增效果較好的2重PCR體系中添加另一對(duì)引物篩選3重PCR體系, 以此類推。以16個(gè)蘭州鲇個(gè)體DNA為模板構(gòu)建多重PCR體系, 通過引物濃度、退火溫度和延伸時(shí)間等因素優(yōu)化篩選最佳擴(kuò)增條件, 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)多重PCR擴(kuò)增效果。

PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)總體積20 μL, 包括DNA 1 μL(約50 ng), Premix 2×Taq(諾維贊)10 μL,正反向引物各0.5 μL(10 pmol/μL, 武漢天一輝生物科技有限公司合成), 加ddH2O至總體積20 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性3min, 94℃變性1min,50—60℃退火45s, 72℃延伸1min, 34個(gè)循環(huán), 72℃延伸10min, 12℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行STR測(cè)序分析(毛細(xì)管電泳檢測(cè)ABI3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀), 最終將優(yōu)化好的微衛(wèi)星多重PCR組合用于蘭州鲇3個(gè)家系的親子鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用GeneMarker軟件[16]讀取等位基因值; 采用χ2檢驗(yàn)家系中各位點(diǎn)分離模式是否滿足孟德爾遺傳定律(1∶1、1∶2∶1 和 1∶1∶1∶1), 顯著性水平設(shè)置為P＞0.01; 用Cervus v.3.0軟件[17]進(jìn)行親子鑒定分析,具體參數(shù)包括等位基因數(shù)(Number of allele,Na)、有效等位基因數(shù)(Number of effective allele,Ne)、觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、香農(nóng)信息指數(shù)(Shannon Wiener index,I)、無效等位基因頻率[Null allele frequency,F(Null)]及多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC), 計(jì)算各位點(diǎn)的平均排除概率(Exclusion probability,EP)、累積排除概率(Combined exclusion probability,CEP)、模擬鑒定率及實(shí)際鑒定率(置信區(qū)間為95%); 利用軟件GenAlex 6[18]計(jì)算110尾個(gè)體和50尾雙盲子代遺傳距離, 采用MEGA 7.0[19]軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星多重PCR建立

本研究從已篩選出多態(tài)性高、擴(kuò)增效率較好的18對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記中, 通過不同組合擴(kuò)增, 最終選取14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)科學(xué)設(shè)計(jì)優(yōu)化確定了2組三重PCR和2組四重PCR, 所建立的各組多重PCR退火溫度、引物濃度以及片段大小見表 1。圖 1為部分蘭州鲇個(gè)體四組多重PCR片段測(cè)序掃描圖, 由圖 1可見4組多重PCR體系各位點(diǎn)擴(kuò)增效率均較好, 易于識(shí)別各位點(diǎn)等位基因大小。

2.2 群體遺傳多樣性分析

4組微衛(wèi)星多重PCR在90尾子代和20尾親本中遺傳參數(shù)如表 2所示。等位基因數(shù)(Na)為4—19, 平均等位基因數(shù)為8.214; 有效等位基因數(shù)(Ne)為2.117—7.704, 平均有效等位基因數(shù)為3.652; 觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.527—0.964和0.528—0.870; 平均觀測(cè)雜合度為0.750, 平均期望雜合度為0.667; 香農(nóng)信息指數(shù)(I)為0.958—2.268,平均香農(nóng)信息指數(shù)為1.393; 14個(gè)位點(diǎn)中有6個(gè)位點(diǎn)(SLsis118、SLsis165、SLsis173、SLsis83、SLsis14和SLsis76)的無效等位基因頻率(F(Null))大于10%;多態(tài)信息含量(PIC)為0.500—0.858, 平均多態(tài)信息含量為0.624, 各位點(diǎn)均表現(xiàn)為高度多態(tài)性(PIC＞0.5)。

2.3 微衛(wèi)星在子代分離模式

由表 3可知, 在獲得的42個(gè)基因型分離比(14位點(diǎn)×3家系)中, 有2個(gè)為同一雜合狀態(tài)基因型(親本等位基因不同且為純合), 對(duì)剩余40個(gè)分離模式進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 排除無效等位基因和無法分析的情況,仍有3個(gè)基因型分離比偏離孟德爾分離定律(P＜0.01), 在3個(gè)家系共168個(gè)等位基因中(14個(gè)位點(diǎn)×6個(gè)親本× 2), 無效等位基因頻率為2.4%。

表 1 四組蘭州鲇微衛(wèi)星多重PCR篩選結(jié)果Tab. 1 The results of 4 multiplex PCR screening in S. lanzhouensis

圖 1 部分蘭州鲇個(gè)體4組多重PCR的基因掃描圖Fig. 1 Part of gene scan results of four sets multiplex PCR in S. lanzhouensis

表 2 14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在蘭州鲇3個(gè)家系中的遺傳參數(shù)Tab. 2 Genetic parameters in 3 families of S. lanzhouensis by using 14 microsatellite makers

表 3 多重PCR在蘭州鲇3個(gè)家系中的微衛(wèi)星基因型分離比Tab. 3 Segregation analysis of microsatellite alleles in 3 families of S. lanzhouensis

續(xù)表 3

2.4 親權(quán)分析

利用4組微衛(wèi)星多重PCR對(duì)蘭州鲇3個(gè)家系進(jìn)行親子鑒定排除概率分析, 由表 4可知, 當(dāng)雙親基因型均未知時(shí), 單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)排除概率(E-1P)為0.097—0.591, 累積排除概率(CE-1P)為0.99753092;當(dāng)單親基因型已知時(shí), 單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)排除概率(E-2P)為0.172—0.745, 累積排除概率(CE-2P)為0.99983971; 當(dāng)雙親基因型均已知時(shí), 單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)排除概率(E-PP)為0.262—0.904, 累積排除概率(CE-PP)為0.99999964。由圖 2可知, 根據(jù)單個(gè)多重PCR組合的鑒定率由高到低依次添加組合, 4組多重PCR模擬累積鑒定率為100%, 實(shí)際累積鑒定率為83%。

2.5 聚類分析

進(jìn)一步利用110尾已知系譜親本及子代個(gè)體遺傳信息進(jìn)行聚類分析驗(yàn)證, 結(jié)果表明在遺傳距離大于0.4時(shí), 3個(gè)家系能夠分別聚類, 鑒定準(zhǔn)確率為95.46%(圖 3)。50尾雙盲子代聚類分析驗(yàn)證結(jié)果表明, 除2號(hào)、15號(hào)和48號(hào)個(gè)體未能確定其親本外, 其余47尾個(gè)體能夠確定其親本, 聚類分析鑒定準(zhǔn)確率為94.00%(圖 4)。

3 討論

3.1 微衛(wèi)星多重PCR建立

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道, 影響多重PCR擴(kuò)增效率的主要因素包括反應(yīng)體系(引物、Mg2+、dNTPs、緩沖液、DNA模板和DNA聚合酶等)和反應(yīng)條件(退火溫度、延伸時(shí)間和循環(huán)數(shù)等)[20—22]。本研究在構(gòu)建蘭州鲇微衛(wèi)星多重PCR體系時(shí)發(fā)現(xiàn), 引物組合及其濃度、退火溫度和延伸時(shí)間是影響多重PCR體系構(gòu)建成敗的主要因素。在引物組合設(shè)計(jì)方面, 要確保同一位點(diǎn)上下游引物及不同引物間不能形成錯(cuò)配、二聚體及發(fā)卡結(jié)構(gòu)。在引物濃度比例設(shè)計(jì)方面, 需進(jìn)行不同引物濃度優(yōu)化篩選, 以避免出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物或擴(kuò)增效率高的引物抑制其他引物導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。在延伸時(shí)間方面, 以優(yōu)化引物組合、引物濃度配比等因素為前提, 尚需進(jìn)行延伸時(shí)間條件篩選, 避免因擴(kuò)增時(shí)間太久導(dǎo)致酶和dNTPs等物質(zhì)缺乏造成無法同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)位點(diǎn)[23]。在退火溫度方面, Kong等[24]認(rèn)為多重PCR體系中各引物間退火溫度相差不宜超過5℃。本研究先對(duì)每對(duì)引物進(jìn)行單位點(diǎn)擴(kuò)增以確定每對(duì)引物退火溫度, 再將退火溫度相差不超過5℃的引物組合進(jìn)行溫度梯度PCR篩選, 最終確定了4組多重PCR最佳退火溫度。

表 4 蘭州鲇親子鑒定的排除概率和累積排除概率Tab. 4 Exclusion probability and cumulative exclusion probability for parentage assignment in S. lanzhouensis

圖 2 已知蘭州鲇雙親基因型時(shí)實(shí)際累積鑒定率和模擬累積鑒定率Fig. 2 The real cumulative assignment rate and simulation cumulative assignment rate with known parental genotypes in S.lanzhouensis

3.2 群體遺傳多樣性分析

生物群體遺傳多樣性常用于評(píng)測(cè)生物種質(zhì)資源狀況[25], 等位基因數(shù)(Na)、雜合度(Ho/He)及多態(tài)信息含量(PIC)則為群體遺傳多樣性的重要評(píng)估指標(biāo), 多態(tài)性越高, 遺傳多樣性水平越高, 則家系親子鑒定的成功率和準(zhǔn)確率就越高[26]。根據(jù)Bostein等[27]所提出的多態(tài)信息含量指標(biāo)范圍:PIC≥0.5時(shí)為高度多態(tài), 0.25≤PIC＜0.5為中度多態(tài),PIC＜0.25為低度多態(tài)。本研究中14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均期望雜合度(He)為0.667, 平均觀測(cè)雜合度(Ho)為0.750,PIC平均值為0.624, 表現(xiàn)為高度多態(tài)。這一結(jié)果與吳旭東等[28]利用蘭州鲇19對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)野生和人工繁育2個(gè)群體遺傳多樣性分析結(jié)果(He0.773,Ho0.887,PIC0.705)相近。以上數(shù)據(jù)表明, 本研究選用的微衛(wèi)星標(biāo)記具有較高的遺傳多樣性, 可用于后續(xù)家系親權(quán)分析。

3.3 微衛(wèi)星在子代分離模式

微衛(wèi)星位點(diǎn)分型時(shí)常存在無效等位基因的情況, 通過子代基因分離比可反應(yīng)研究中無效等位基因的存在情況。通過本研究14個(gè)位點(diǎn)在子代中的分離模式發(fā)現(xiàn), 排除無效等位基因和無法分析的情況, 仍有3個(gè)基因型分離比偏離孟德爾分離定律。同樣, 陳辰等[29]和聶鴻濤等[11]分別應(yīng)用10對(duì)和12對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)進(jìn)行子代基因分離模式研究, 在考慮無效等位基因存在的情況下, 發(fā)現(xiàn)分別有2個(gè)和8個(gè)位點(diǎn)基因型分離比偏離孟德爾分離定律。由此結(jié)合相關(guān)研究推測(cè), 在基因轉(zhuǎn)換、減數(shù)分裂過程中, 因染色體非隨機(jī)分離或同致死主效基因連鎖等原因, 可造成此類現(xiàn)象發(fā)生[30]。

圖 3 110個(gè)體聚類分析圖Fig. 3 The cluster analysis diagram in 110 S. lanzhouensis

3.4 親權(quán)分析

近些年來, 親權(quán)關(guān)系分析被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源保護(hù)、系譜信息完善、遺傳參數(shù)分析及良種新品種選育等方面[31]。在親子鑒定中, 基于排除概率的遺傳排除法是進(jìn)行系譜關(guān)系鑒定最為簡(jiǎn)單有效的方法[32]。王敏[33]研究表明, 若CEP≥99.73% 時(shí),則可認(rèn)定存在親子關(guān)系; 若95%＜CEP≤99%時(shí), 則有可能存在親子關(guān)系; 若CEP＜80%時(shí), 則不能確定存在親子關(guān)系。陳亮等[34]利用長鰭吻鮈(Rhinogo-bio ventralis)15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)構(gòu)建了5組三重PCR體系, 僅使用其中3個(gè)組合, 在單親基因型已知情況下,其累積排除率可達(dá)到99.99%以上。本研究利用蘭州鲇14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)構(gòu)建了2組四重PCR和2組三重PCR體系, 以排除法分析蘭州鲇家系間親子關(guān)系,無論親本基因型是否已知, 其累積排除概率均大于99.73%, 因此4組微衛(wèi)星多重PCR可用于鑒定蘭州鲇家系間親權(quán)關(guān)系。

圖 4 50個(gè)雙盲個(gè)體聚類分析結(jié)果Fig. 4 Cluster analysis of 50 double-blind individuals

本研究中14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)模擬鑒定率可達(dá)100%,而實(shí)際鑒定率為83%, 這與有關(guān)翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)[35]和黃喉擬水龜(Mauremys mutica)[21]的研究結(jié)果相似。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道, 家系親本選擇、無效等位基因存在及基因型統(tǒng)計(jì)誤差等因素均可造成實(shí)際鑒定率小于模擬鑒定率的現(xiàn)象。本研究選用家系親本來自多個(gè)池塘經(jīng)群體選育后進(jìn)一步選擇優(yōu)秀個(gè)體進(jìn)行同池塘混合培育的優(yōu)良個(gè)體, 選育中仍存在因三代繁育、人工選擇及人為誤差等造成其親緣關(guān)系較近的可能, Jones等[32]認(rèn)為親本親緣關(guān)系過近會(huì)降低親子鑒定的準(zhǔn)確性。其次, 本研究中有6個(gè)位點(diǎn)的無效等位基因頻率大于10%, 無效等位基因會(huì)導(dǎo)致樣本雜合子缺失和低質(zhì)量DNA, 從而影響鑒定準(zhǔn)確度[36]。此外, 本研究中熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序儀ABI 3730xl進(jìn)行熒光電泳檢測(cè), 其擴(kuò)增效果差異、DNA模板質(zhì)量以及檢測(cè)軟件讀取等因素亦可影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

3.5 聚類分析

基于可靠分子標(biāo)記的聚類分析常用于物種鑒定分類、起源進(jìn)化等方面[37,38]。為進(jìn)一步驗(yàn)證親子鑒定準(zhǔn)確性, 本研究通過110尾已知系譜親本及子代個(gè)體和50尾雙盲子代聚類分析發(fā)現(xiàn), 鑒定準(zhǔn)確率可分別達(dá)到95.46%和94.00%。50尾雙盲個(gè)體聚類分析中出現(xiàn)3尾樣本聚類錯(cuò)誤, 可能因某些位點(diǎn)擴(kuò)增效率過低和目標(biāo)片段差異過小引起基因型統(tǒng)計(jì)誤差, 及在PCR擴(kuò)增中引物滑動(dòng)等原因造成[39]?；谶z傳排除法和聚類分析的結(jié)果表明, 本研究建立的4組多重PCR體系具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。

4 結(jié)論

本研究在蘭州鲇單個(gè)PCR的基礎(chǔ)上首次建立多重PCR體系, 更加經(jīng)濟(jì)和高效地應(yīng)用于不同種質(zhì)混養(yǎng)保存、種質(zhì)選配擴(kuò)繁、選育系譜管理和親子鑒定等研究, 為蘭州鲇這一大型瀕危物種的種質(zhì)資源救護(hù)和良種選育提供了重要技術(shù)支持。