何晉, 尋治銘, 謝飛, 儀楊, 劉夢昱, 趙鵬翔

1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院，北京 100020

氫氣是一種無色無味、在水中溶解度較低、并具有還原性的氣體。早在20世紀(jì)90年代就發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)腸道菌群可以通過發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生氫氣，并通過消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)排出體外[1]，但當(dāng)時認(rèn)為氫氣是一種生理惰性氣體。1975年，Dole等[2]首次在小鼠皮膚鱗癌模型中報道了高壓下(8個大氣壓)呼吸高濃度氫氣(97.5%)的抗腫瘤作用。2007年，Ohsawa等[3]首次證明了正常大氣壓下呼吸低濃度氫氣(1%～4%)對大鼠腦缺血再灌注損傷具有顯著的保護作用，并認(rèn)為這種保護作用可能是通過選擇性清除毒性自由基介導(dǎo)的。由于氫氣分子量小，可輕易穿過血腦屏障結(jié)構(gòu)[4]，除腦缺血再灌注損傷外，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)氫氣對帕金森病、阿爾茨海默病、顱腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有一定的改善作用[5-7]，氫氣對大鼠顱腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)具有顯著的改善作用，主要表現(xiàn)為減少神經(jīng)元的丟失，抑制損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化[8]。除中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病外，目前研究發(fā)現(xiàn)氫氣在心血管系統(tǒng)疾病[9-13]、免疫系統(tǒng)疾病[14-17]、呼吸系統(tǒng)疾病[18-20]、代謝性疾病[21-23]和腫瘤[24-27]等多種疾病中均表現(xiàn)出正面的改善功能。

目前臨床試驗和動物實驗中氫氣的干預(yù)方式主要有飲用富氫水(hydrogen-rich water, HRW)、吸氫、氫沐浴、注射富氫生理鹽水或食用能促進(jìn)釋放氫氣的食物等[28]。飲用富氫水是常見的氫氣干預(yù)方式，很多研究都采用飲用富氫水的干預(yù)方式[29]，但是大多數(shù)研究都是在疾病狀態(tài)下進(jìn)行的，并且干預(yù)時間也相對較短。長期飲用富氫水對正常機體的生理功能是否會產(chǎn)生影響尚不清楚。為獲得更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，本研究選用健康大鼠飲用富氫水12個月，之后由于疫情原因中止飲用富氫水6個月(僅飲用正常水)，在第18個月檢測各種生理指標(biāo)的變化，以期獲得正常機體長期飲用富氫水的數(shù)據(jù)，為富氫水相關(guān)干預(yù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 富氫水

富氫水購買自北京活力氫源飲品有限公司。

1.2 實驗動物與分組

20只6周齡SD雄性大鼠，體重80～100 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。所有實驗動物均在清潔級動物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22～25 ℃，空氣相對濕度40%～70%，12 h/12 h明暗交替。實驗前，動物適應(yīng)實驗環(huán)境一周，并將其隨機分為兩組：對照組(CTL)和富氫水組(HRW)，每組10只，并用耳釘進(jìn)行標(biāo)號。HRW組大鼠每天上午8:00和下午5:00各飲用富氫水1 h，CTL組大鼠以同樣的時間段飲用純凈水，其余時間禁水，兩組大鼠自由飲食，共處理12個月，之后由于疫情原因中止飲用富氫水6個月(僅飲用正常水)。在第18個月，對大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.3 大鼠體重和臟器重量的稱量

實驗結(jié)束后，對兩組大鼠進(jìn)行活體稱重。在做完其他活體指標(biāo)檢測后，最后將其統(tǒng)一麻醉處死，迅速剖開腹腔和胸腔，取出心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和腦組織，生理鹽水清洗臟器表面并用濾紙吸干液體，立即稱量。

1.4 代謝籠實驗收集實驗大鼠的飲水量、進(jìn)食量、排尿量和排便量

實驗結(jié)束前一天上午8:00點，將兩組大鼠放入代謝籠中，分別在食槽內(nèi)和飲水瓶內(nèi)加入飼料50 g和飲用水200 mL。次日上午8:00取出代謝籠下方的抽屜，收集糞網(wǎng)上的糞便放天平上稱量，即為排便量; 收集尿盒內(nèi)的尿液用量筒稱量，即為排尿量。并測量大鼠的進(jìn)食量和飲水量，進(jìn)食量=50-剩余飼料量(g)，飲水量=200-剩余水量(mL)。

1.5 超聲心動圖檢測大鼠的心臟功能

實驗結(jié)束前一天，應(yīng)用彩色多普勒超聲心動圖對兩組大鼠進(jìn)行心臟超聲學(xué)檢查。將大鼠仰臥位固定，異氟烷持續(xù)性吸入麻醉，胸部脫毛處理，將探頭置于大鼠左胸前，以胸骨旁左室長軸和乳頭肌水平短軸切面，調(diào)整好角度測定心率(heart rate, HR)、左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)、左心室質(zhì)量(left ventricular mass, LV Mass)、左心室軸縮短率(left ventricular fractional shortening, FS)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume, LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume, LVESV)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)、左心室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension, LVESD)等心臟功能評價指標(biāo)。連續(xù)測3次，結(jié)果取平均值。

1.6 血液常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)檢測

1.6.1血液采集實驗結(jié)束前一天晚上8:00開始，所有大鼠禁食，不禁水。次日采用3%異氟烷對大鼠進(jìn)行麻醉，避免動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。從大鼠尾靜脈采血，其中約1 mL置于含促凝劑的促凝管中，用于血清生化指標(biāo)的檢測；1 mL置于EDTA·K2抗凝管中，用于血液常規(guī)指標(biāo)的檢測。

1.6.2血液常規(guī)指標(biāo)的檢測使用全自動血液生理分析儀測定大鼠血液常規(guī)指標(biāo)，嚴(yán)格遵守儀器使用說明書進(jìn)行操作。測定指標(biāo)包括白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)、血紅蛋白平均含量(MCHGB)、血紅蛋白平均濃度(MCHC)、血小板濃度(PLT)、中性粒細(xì)胞數(shù)(neutrophils)、嗜酸性粒細(xì)胞(eosnophils)、嗜堿性粒細(xì)胞(basophils)、淋巴細(xì)胞(lymphocytes)、平均紅細(xì)胞體積(MCVU)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW-SD)等。

1.6.3血清生化指標(biāo)的檢測促凝管中的血液樣品在室溫靜置30 min后，以3 000 r·min-1離心10 min，收集上層血清樣品，并采用西門子2 400全自動生化分析儀測定血清生化指標(biāo)，包括空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、甘油三脂(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、總膽汁酸(total bile acid, TBA)、尿酸(uric acid, UA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase, GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase, GOT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB, CK-MB)、α-羥丁酸脫氫酶(α-hydroxybutyrate, α-HBDH)等，實驗操作嚴(yán)格按照儀器使用說明進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行非配對t-test統(tǒng)計分析，各項指標(biāo)數(shù)值以Mean±SEM表示，以P<0.05判定為差異統(tǒng)計學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 富氫水對大鼠體重和臟器重量的影響

為了探究長期飲用富氫水對大鼠體重和臟器重量的影響，分別對兩組大鼠做了體重稱量和各臟器的稱量。如圖1所示，和CTL相比，HRW組大鼠腦組織重量顯著升高(P<0.05)，而大鼠體重和其他臟器重量，包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟均無顯著性變化(P>0.05)。

注：*—富氫水組(HRW)和對照組(CTL)間的差異在P<0.05 水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 富氫水對大鼠飲水進(jìn)食和排泄量的影響

為了探究長期飲用富氫水對大鼠飲食進(jìn)水和排泄量的影響，代謝籠法測定大鼠進(jìn)食量、飲水量、排尿量和排便量。如圖2所示，HRW組較CTL組各項指標(biāo)無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 富氫水對大鼠飲水進(jìn)食和排泄量的影響

2.3 富氫水對大鼠心臟功能的影響

為了探究長期飲用富氫水對大鼠心臟功能是否有顯著性影響，應(yīng)用多普勒超聲技術(shù)對大鼠做心臟彩超。如圖3所示，與CTL組相比，HRW組大鼠的心率(HR)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室軸縮短率(FS)、左心室質(zhì)量(LV Mass)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)均無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 富氫水對大鼠心臟功能的影響

2.4 富氫水對大鼠血液常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的影響

為了進(jìn)一步探究長期飲用富氫水對大鼠血液指標(biāo)的影響，我們對兩組大鼠進(jìn)行了血液常規(guī)指標(biāo)檢測和血液生化指標(biāo)檢測。血常規(guī)檢測結(jié)果如表1所示，與CTL組相比，HRW組大鼠的各項血常規(guī)指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果如表2所示，與CTL組相比，HRW組大鼠血清甘油三酯(TG)水平顯著升高(P<0.05)，而其他生化指標(biāo)較CTL組無顯著性變化(P>0.05)。

表1 富氫水對大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響

表2 富氫水對大鼠血清生化指標(biāo)的影響

3 討論

迄今為止，關(guān)于氫氣生物學(xué)效應(yīng)的科研論文已發(fā)表超過1 400篇，動物實驗和臨床試驗證據(jù)均表明氫氣對各種疾病有預(yù)防、治療或保護作用，因此氫氣被普遍認(rèn)為具有很好的臨床應(yīng)用前景。目前使用氫氣的安全性也被廣泛認(rèn)可，其原因主要在于以下幾方面：一是由于氫氣與體內(nèi)自由基等物質(zhì)反應(yīng)后生成水，并不會生成其他有害副產(chǎn)物；另一個重要證據(jù)來自于潛水醫(yī)學(xué)研究，氫氣很早就用于人類潛水作業(yè)，實踐證明持續(xù)暴露于20個大氣壓的氫氣分壓環(huán)境下并不會對人體產(chǎn)生任何毒性效應(yīng)。由于這種氫氣劑量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過常壓下氫氣的使用劑量，這就有力地支持了常壓下使用氫氣的安全性；此外，目前關(guān)于氫氣的動物實驗和臨床試驗中也均無氫氣毒副作用的報道。然而以上這些證據(jù)并不能說明氫氣干預(yù)就一定沒有副作用，尤其是長期氫氣干預(yù)是否會對機體生理功能產(chǎn)生影響還需要更多的動物實驗和臨床試驗的數(shù)據(jù)支持。

為了研究長期飲用富氫水的安全性，本研究以SD大鼠為研究對象，實驗的時間跨度從大鼠6周齡開始一直到大鼠19.5個月齡，其中飲用富氫水時間12個月，然后飲用正常水6個月，換算成人的年齡相當(dāng)于從10歲開始飲用富氫水到35歲，此后飲用正常水到50歲時檢測各項生理指標(biāo)的變化。在我們前期的一項研究發(fā)現(xiàn)，飲用富氫水6個月對大鼠體重、GLU、UA、ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)均無顯著性影響[30]，這些指標(biāo)在本研究中也無顯著性變化。然而在臟器重量指標(biāo)中我們發(fā)現(xiàn)，長期飲用富氫水后的大鼠腦組織重量有所增加，考慮到本研究的實驗周期較長，而隨著大鼠年齡的增加，其大腦會逐漸萎縮，重量減輕，因此該結(jié)果提示富氫水可能在防護腦組織萎縮方面發(fā)揮積極作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，長期飲用富氫水可使血清TG水平升高，這與前期研究結(jié)果一致，前期研究發(fā)現(xiàn)從富氫水干預(yù)4個月開始TG水平就有上升趨勢，該結(jié)果提示飲用富氫水對血清TG水平的影響需要一定時間，同時對TG的影響即使在富氫水干預(yù)終止后也會持續(xù)很久。前期研究中還發(fā)現(xiàn)飲用富氫水后膽固醇水平下降，表現(xiàn)為TC、LDL-C(低密度脂蛋白)和HDL-C(高密度脂蛋白)在飲用富氫水2個月后均有所下降，但是在本研究中發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)與對照均無顯著性差異，提示富氫水對膽固醇的影響會隨著富氫水干預(yù)的終止而消失。結(jié)合兩項研究來看，富氫水對TBA的影響可能在干預(yù)的早期(從第2周到第2個月)出現(xiàn)，從飲用富氫水第4個月開始，TBA水平與對照組已無顯著性差異。此外，前期研究還發(fā)現(xiàn)，富氫水干預(yù)后心肌酶活性的變化最為迅速，從飲用富氫水第2周開始直到第6個月，LDH、α-HBDH、CK和CK-MB活性均有所下降，而本研究中這些酶的活性與對照組相比均無顯著性差異。該結(jié)果提示，雖然飲用富氫水很快會對心肌酶活性產(chǎn)生影響，但是這種影響會隨著富氫水干預(yù)的終止而消失。

需要指出的是，本研究最初擬評估長期飲用富氫水對大鼠生理指標(biāo)的影響，但是由于2020年新冠疫情影響，富氫水一共干預(yù)了12個月，大鼠在后6個月飲用正常水。雖然疫情對本研究結(jié)果會產(chǎn)生一定影響，但是通過與前期研究結(jié)果進(jìn)行比較，我們可以更加深入地評估富氫水對大鼠正常生理指標(biāo)的影響，尤其是可以評估富氫水對生理指標(biāo)影響的持久性。綜上所述，本研究通過對富氫水干預(yù)后長期影響效果的觀察發(fā)現(xiàn)：①長期飲用富氫水對血常規(guī)/血糖/肝功能無顯著影響；②血清甘油三酯水平顯著升高，而膽固醇、膽汁酸和尿酸水平無顯著變化；③對心臟功能無顯著影響；④腦組織重量有升高；⑤對體重、飲食進(jìn)水和排泄量無顯著影響。本研究一方面具有一定的基礎(chǔ)研究價值，同時對未來的氫氣臨床研究有一定的參考意義。