張蕾 李媛媛 陳曦 劉海婷 徐建 王寧 丁楊明 陸宇

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的，嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳染性疾病，至今仍是造成死亡人數(shù)最多的單一傳染病之一[1]。隨著耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的傳播和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn)，強(qiáng)效的一線抗結(jié)核藥品作用受限，而二線抗結(jié)核藥品又存在費(fèi)用高、療程長、治愈率低、不良反應(yīng)大等問題。目前全球結(jié)核病的治愈率為83%，而MDR-TB和XDR-TB的治愈率則僅有54%(中國為41%)和30%[2]?，F(xiàn)有抗結(jié)核藥物不能滿足臨床治療需求，迫切需要具有新作用機(jī)制的抗結(jié)核藥物。

近年來氯法齊明(clofazimine，Cfz)的抗結(jié)核活性已得到證實(shí)，多項(xiàng)含Cfz的短程化療方案均取得了令人矚目的治療效果，2019年的WHO耐多藥或利福平耐藥結(jié)核病治療指南[3]和《中國耐多藥和利福平耐藥結(jié)核病治療專家共識(2019年版)》[4]都把Cfz作為治療耐藥結(jié)核病的核心藥品。但是，Cfz導(dǎo)致的皮膚紅染等不良反應(yīng)使得Cfz的廣泛應(yīng)用受到限制。吡法齊明(pyrifazimine，TBI-166)是在Cfz結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改造獲得的新型亞胺吩嗪類抗結(jié)核藥品，是中國第一個(gè)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗結(jié)核新藥。TBI-166的體外活性更高，且對藥物敏感結(jié)核分枝桿菌、耐藥結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌和非復(fù)制期結(jié)核分枝桿菌均有效[5]。最重要的是，其引起的皮膚染色卻比Cfz少，目前已開展Ⅱ期臨床試驗(yàn)(登記號：CTR20202345)，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

本課題組對TBI-166的作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討，證實(shí)了TBI-166可能與Cfz有相似的作用機(jī)制，通過累積活性氧(reactive oxygen species，ROS)發(fā)揮殺菌作用[6]。并且利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)量化分析結(jié)核分枝桿菌受到TBI-166作用后蛋白表達(dá)的改變，發(fā)現(xiàn)差異蛋白醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase, QOR；A0A045HJH7)在TBI-166處理組各樣本中均有顯著變化。本研究是利用分子生物學(xué)的方法對MtbQOR蛋白進(jìn)行表達(dá)純化，鑒定TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)的影響，同時(shí)研究了TBI-166處理結(jié)核分枝桿菌后NADPH/NADP+比值的變化以及結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離菌株內(nèi)ROS含量的變化。對TBI-166的抗結(jié)核作用機(jī)制開展進(jìn)一步的探索。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)菌株

結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC 27294)，MDR-TB 患者的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株菌株號為11195及11492(對TBI-166及Cfz耐藥)、12897(對TBI-166及Cfz敏感)、15171(對TBI-166敏感，對Cfz耐藥)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院/北京市耐藥結(jié)核病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供，對TBI-166及Cfz的藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)通過微孔培養(yǎng)顯色法(microplate alamar blue assay，MABA)進(jìn)行測定。

二、實(shí)驗(yàn)藥物

TBI-166[純度≥99.0%，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所(北京)黃海洪教授課題組提供]、異煙肼(美國Sigma公司；批號：060M0090；質(zhì)量：50 g；純度≥99.0%)、利福平(RFP；美國Sigma公司；批號：WXBB7288V；質(zhì)量：5 g；純度≥97.0%)。

三、儀器與試劑

1.儀器：Infinite 200多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan 公司)、Nuaire701二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國Nuaire 公司)、GENEPRO多功能基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)、DS-11FX超微量分光光度計(jì)(美國DeNovix公司)、Tanon-4200全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、AKTA pure 25蛋白純化系統(tǒng)(美國Gene公司)、SYNERGY酶標(biāo)儀(美國 BIOTEK 公司)、1730R微量高速冷凍離心機(jī)(美國Gene公司)、Max-Q8000低溫?fù)u床(美國Thermo公司)。

2.試劑：pET32a質(zhì)粒(重慶優(yōu)寶生物技術(shù)股份有限公司；批號：y32014)、BamHⅠ[寶生物工程(大連)有限公司；批號：AHG2027A]、XhoⅠ[寶生物工程(大連)有限公司；批號：AG60621A]、E.coli BL21(DE3)(北京全式金生物技術(shù)有限公司；批號：O20811)、細(xì)菌ROS檢測試劑盒(上海貝博公司；批號：BB20081)、叔丁基過氧化氫(TBHP；美國Sigma公司；批號：SHBB7856V)、輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司；批號：20191223)、菲醌(上海麥克林生化科技有限公司；批號：C10005539)、NADPH(還原型輔酶Ⅱ；上海碧云天生物技術(shù)有限公司；批號：091919201106)。

四、MtbQOR蛋白表達(dá)與純化

采用PCR方法從滅活的H37Rv菌株中擴(kuò)增MtbQOR(Rv1454c)基因，并克隆至BamHⅠ和XhoⅠ限制位點(diǎn)之間的pET32a質(zhì)粒，得到的蛋白在MtbQOR的N-末端含有硫氧還蛋白/His6標(biāo)簽，相對分子質(zhì)量約為53 000。MtbQOR在Luria-Bertani培養(yǎng)基(含100 μg/ml氨芐青霉素)大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)生長至對數(shù)生長期(A600 nm達(dá)到0.6)，用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h。細(xì)胞在室溫下8000×g離心機(jī)離心15 min，然后在含有25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、pH 8.0的裂解緩沖液中再懸浮和裂解。上清液在12 000×g離心機(jī)離心40 min，得到含有可溶性靶蛋白的上清液加載到Ni柱。靶蛋白使用含有25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH值 8.0的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。將含有蛋白質(zhì)的組分匯集在一起，進(jìn)行濃縮除鹽，并在-80 ℃下儲存至進(jìn)一步使用。通過SDS-PAGE估計(jì)蛋白質(zhì)的純度>95%。

五、TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)影響

MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)特異的以NADPH為H+供體，NADPH在波長340 nm下有特異吸收峰，通過酶標(biāo)儀檢測吸光度值(A340 nm)下NADPH下降程度(ΔA)可以反映MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)發(fā)生程度。反應(yīng)在25 ℃，150 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值7.0，0.12 mmol/L NADPH，0.05 mg/ml MtbQOR，25 μmol/L底物混合體系中測定。通過添加含有MtbQOR蛋白質(zhì)的相同緩沖溶液作為反應(yīng)開始，立即測定波長340 nm下的初始吸光度值A(chǔ)1，在不加入TBI-166或加入不同濃度的TBI-166情況下測定20 min后波長340 nm下的吸光度值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2[7-8]。

六、結(jié)核分枝桿菌ROS含量測定

H37Rv菌株和各臨床分離菌株生長至對數(shù)生長期，對H37Rv菌株設(shè)置加TBI-166組(0.03、0.3、3 μg/ml)、加RFP組(0.025、0.25、2.5 μg/ml)、空白對照組及陽性對照組；對各臨床分離菌株設(shè)置加TBI-166組(0.03、0.3、3 μg/ml)、空白對照組及陽性對照組，陽性對照組為TBHP處理組，在藥物作用24 h后進(jìn)行取樣[9]。通過8000×g離心機(jī)離心10 min獲得細(xì)菌培養(yǎng)物并重新懸浮，在O11探針中37 ℃避光孵育30 min。8000×g離心機(jī)離心10 min收集菌體，在磷酸鹽緩沖液中洗滌，并在測量前再次重懸，將200 μl每個(gè)樣品裝入黑色底部透明96孔板中。設(shè)置激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm檢測熒光值。

七、結(jié)核分枝桿菌NADPH/NADP+比值測定

采用輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測試劑盒對結(jié)核分枝桿菌NADPH/NADP+比值進(jìn)行測定。H37Rv菌株生長至對數(shù)生長期，設(shè)置加TBI-166組(0.03、0.3、3 μg/ml)及空白對照組，在藥物作用6、12、24、48、96 h后進(jìn)行取樣。通過8000×g離心機(jī)離心10 min 獲得細(xì)菌培養(yǎng)物，分別用酸性和堿性提取液提取結(jié)核分枝桿菌中的NADP+和NADPH。NADPH通過PMS的遞氫作用，可以使氧化型噻唑藍(lán)(MTT)還原為甲瓚，使用酶標(biāo)儀在波長570 nm下檢測吸光度值。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP+為NADPH，從而檢測NADP+含量。進(jìn)而計(jì)算兩者比值。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、MtbQOR蛋白表達(dá)、純化

對經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌株BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c進(jìn)行SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量約53 000處出現(xiàn)目的蛋白條帶，而菌株BL21(DE3)及空載菌株BL21(DE3)-pET32a無此條帶(圖1)，表明Rv1454c基因在大腸桿菌中得到了成功表達(dá)。目的蛋白在細(xì)菌裂解上清和包涵體均有表達(dá)，收集上清用Ni-NTA親和純化柱純化目的蛋白，通過Western Blot確定是目的蛋白(圖2)并且通過SDS-PAGE確定得到的蛋白純度>95%(圖3)。

注 M：蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；l：BL21(DE3)全菌；2:不含目的蛋白重組BL21(DE3)-pET32a全菌；3：上樣緩沖液；4：未誘導(dǎo)重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；5：誘導(dǎo)2 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；6：誘導(dǎo)4 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；7：誘導(dǎo)16 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；8: 誘導(dǎo)18 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌圖1 重組蛋白Rv1454c的SDS-PAGE電泳分析

注 M:蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:Ni-NTA純化后的Rv1454c蛋白圖2 Ni-NTA純化后的Rv1454c蛋白Western Blot驗(yàn)證

注 M:蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:Ni-NTA純化后的Rv1454c蛋白圖3 純化的重組蛋白Rv1454c SDS-PAGE電泳分析

二、MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)監(jiān)測

隨著加入TBI-166濃度的增高，NADPH下降的程度(ΔA)更大。與空白對照組ΔA(0.316±0.032)比較，0.03、0.3、3 μg/ml TBI-166組ΔA(0.506±0.107、0.531±0.054、0.801±0.079)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.799，P<0.05；t=-7.634，P<0.01；t=-12.683，P<0.01) (圖4)。

注 ΔA為波長340 nm下NADPH吸光度的下降程度， a：P<0.05，b：P<0.001圖4 不同濃度TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)影響

注 A～E圖分別是不同濃度TBI-166作用6、12、24、48及96 h的NADPH/NADP+比值圖5 不同濃度TBI-166作用H37Rv不同時(shí)間NADPH/NADP+比值

三、不同濃度TBI-166作用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株后NADPH/NADP+比值測定

不同濃度TBI-166作用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株后分別對作用6、12、24、48、96 h的NADPH/NADP+的比值進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示(圖5)，在6、12、24及48 h與同一檢測時(shí)間點(diǎn)空白對照組相比，加入TBI-166藥物的各處理組NADPH/NADP+的比值均降低，空白組的NADPH/NADP+的比值為1.728±0.384，而加TBI-166組的NADPH/NADP+比值為0.847±0.229。并且，隨著作用時(shí)間的延長，NADPH/NADP+的比值逐漸降低，在TBI-166作用48 h之后，NADPH/NADP+的比值達(dá)到最低，而在96 h，各TBI-166組的NADPH/NADP+的比值上升接近空白對照組的比值(圖6)。

圖6 不同濃度TBI-166作用H37Rv后NADPH/NADP+比值隨時(shí)間變化曲線

注 A：不同濃度TBI-166作用H37Rv 24 h后ROS熒光值；B：不同濃度RFP作用H37Rv 24 h后ROS熒光值；C：不同濃度TBI-166作用菌株12897 24 h后ROS熒光值；D：不同濃度TBI-166作用菌株15171 24 h后ROS熒光值；E：不同濃度TBI-166作用菌株11492 24 h后ROS熒光值；F：不同濃度TBI-166作用菌株11195 24 h后ROS熒光值，a:P<0.05，b:P<0.01，c:P<0.001圖7 不同濃度TBI-166刺激各菌株24 h菌體ROS熒光值

四、不同濃度TBI-166刺激結(jié)核分枝桿菌各菌株后的菌體細(xì)胞ROS含量測定

TBI-166刺激H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株及各臨床分離株后的菌體細(xì)胞熒光強(qiáng)度值在刺激24 h后達(dá)到最大，記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)。在H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株中，TBI-166刺激組ROS熒光值為23 072±2584，明顯高于空白對照組(8282±448)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.334，P<0.01)。不同濃度的RFP刺激均不能引起ROS的上升(圖7A～B)，與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=261.392，P>0.05)。在菌株號為12897菌株中，TBI-166刺激組ROS熒光值為18 369±3118，明顯高于空白對照組(12 268±2735)(圖7C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.026，P<0.05)。在菌株號為15171菌株中，0.03、0.3 μg/ml TBI-166刺激菌體ROS含量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=122.601，P>0.05)，3 μg/ml TBI-166刺激組ROS熒光值為17 572±249，明顯高于空白對照組(11 109±343)(圖7D)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.601，P<0.01)。菌株號為11492及11195菌株，在這兩株菌中，TBI-166刺激組與空白對照組相比熒光值接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=161.440，P>0.05；F=44.788，P>0.05)，而陽性對照TBHP組可以明顯刺激菌體產(chǎn)生ROS(圖7E～F)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=161.440，P<0.01；F=44.788，P<0.01)。

討 論

TBI-166是Cfz的結(jié)構(gòu)改造物，在臨床前研究中，展現(xiàn)了與Cfz相當(dāng)?shù)目菇Y(jié)核活性，并且降低皮膚紅染不良反應(yīng)[10]。在比格犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究表明其屬于低清除率藥物[11]。在BALB/c小鼠中，與對照方案INH+RFP+PZA相比，5種含TBI-166的方案在治療4周后顯示出更好的療效[12]。最新一項(xiàng)研究表明，每日一次給予TBI-166比間歇給藥方案更有效[13]，TBI-166擁有替代Cfz進(jìn)入臨床治療的潛能。本研究對抗耐藥結(jié)核新藥TBI-166通過MtbQOR介導(dǎo)，累積ROS的機(jī)制進(jìn)行探討，為TBI-166 Ⅱb期臨床試驗(yàn)的組合方案提供合理充分的理論依據(jù)。

MtbQOR為醌氧化還原酶，以NADPH為H+供體，介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)過程中會生成活性氧自由基，包括超氧陰離子、過氧化物和羥自由基[14]。本研究發(fā)現(xiàn)加入不同濃度的TBI-166均可以增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)的還原反應(yīng)，3 μg/ml TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原中NADPH下降程度是空白對照組的2.5倍，0.03、0.3 μg/ml TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原中NADPH下降程度是空白對照組的1.6、1.7倍。Cfz是具有氧化還原活性的分子，其可在NDH-2醌氧化還原酶的作用下被還原，生成活性還原型Cfz，接著還原型Cfz在O2的作用下生成活性氧物質(zhì)，通過累積ROS發(fā)揮抗結(jié)核作用[15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TBI-166可以增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)，因此推測，TBI-166 與MtbQOR的底物醌競爭電子被還原，被還原后的TBI-166隨后氧化并產(chǎn)生超氧化物和過氧化氫之類的ROS發(fā)揮作用。

NADPH是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成成分，在細(xì)胞防御ROS損傷方面起著重要的作用，NADPH的氧化形式是NADP+，測定結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)的NADPH/NADP+比值一方面可以反映菌體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)[16]，另一方面代表MtbQOR催化反應(yīng)的發(fā)生方向。在本研究中，測定不同濃度TBI-166處理H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株后顯示TBI-166可以降低結(jié)核分枝桿菌內(nèi)NADPH/NADP+的比值，證實(shí)結(jié)核分枝桿菌內(nèi)反應(yīng)向著消耗NADPH，生成NADP+的方向進(jìn)行，結(jié)核分枝桿菌受到TBI-166作用后，菌體內(nèi)氧化還原水平活躍，提示MtbQOR的還原反應(yīng)活躍，這與TBI-166增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)研究結(jié)果一致。并且我們發(fā)現(xiàn)在96 h NADPH/NADP+比值在TBI-166處理組與空白對照組接近，這可能與TBI-166作用后結(jié)核分枝桿菌的代謝代償有關(guān)，經(jīng)過藥物處理后的結(jié)核分枝桿菌為了抵抗TBI-166的作用，經(jīng)過代償活動，產(chǎn)生更多的NADPH，在96 h使得NADPH/NADP+的比值恢復(fù)到正常水平。

結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌體內(nèi)ROS的含量在TBI-166作用24 h后有顯著的變化，與空白對照組相比有2倍左右的上升，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的RFP作用H37Rv菌株后并不能引起ROS含量的變化，這與RFP可能具有抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)[17]，提示結(jié)核分枝桿菌內(nèi)ROS的累積可能是TBI-166特異性發(fā)揮作用的途徑。此結(jié)論在結(jié)核分枝桿菌臨床株中得到證實(shí)，對TBI-166 耐藥的菌株(11492、11195)中均不能觀察到ROS含量的上升，而TBI-166敏感的菌株中(12897)觀察到與H37Rv相似的結(jié)果。

值的注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)3 μg/ml TBI-166增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)明顯高于0.03、0.3 μg/ml TBI-166，而不同濃度TBI-166作用H37Rv后NADPH/NADP+的比值接近，提示0.03、0.3 μg/ml TBI-166作用結(jié)核分枝桿菌后可能不僅通過MtbQOR途徑消耗NADPH，還存在其他消耗NADPH的方式。在ROS實(shí)驗(yàn)中，筆者觀察到菌株15171中，0.03、0.3 μg/ml TBI-166對菌體ROS的刺激作用較3 μg/ml TBI-166弱，進(jìn)一步分析菌株15171對Cfz耐藥，提示0.03、0.3 μg/ml TBI-166與Cfz的作用機(jī)制存在交叉部分。NDH-2貢獻(xiàn)電子是結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈的起始，Cfz通過競爭NDH-2貢獻(xiàn)電子累積ROS而影響結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈[15, 18]，NADPH可以提供H給NAD+生成NADH參與氧化呼吸鏈的H傳遞[9]。因此推測0.03、0.3 μg/ml TBI-166可能通過降低NADPH的相對含量，使得NADPH提供給NAD+的H變少，進(jìn)而使進(jìn)入氧化呼吸鏈的NADH含量變少，發(fā)揮抗結(jié)核作用。

根據(jù)本研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TBI-166增強(qiáng)MtbQOR 介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)，累積ROS發(fā)揮抗結(jié)核作用，并且可能通過降低NADPH/NADP+的比值，降低NADPH的相對含量影響結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈(圖8)。TBI-166的抗結(jié)核作用機(jī)制研究，將進(jìn)一步充實(shí)和豐富吩嗪類藥物抗結(jié)核作用機(jī)制的理論依據(jù)；為其后期的臨床合理組合用藥提供理論依據(jù)；對新型藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及新型抗生素的研發(fā)具有一定的潛在借鑒和應(yīng)用價(jià)值，對將來臨床分子診斷等具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

注 O2：氧；ROS：活性氧；QOR：醌氧化還原酶；TBI-166red：還原型TBI-166；TBI-166ox：氧化型TBI-166；NADPH：還原型輔酶Ⅱ；NADP+：氧化型輔酶Ⅱ；Electron Transport Chain：電子呼吸鏈；NADH：還原型輔酶Ⅰ；NAD+：氧化型輔酶Ⅰ；ADP：二磷酸腺苷；ATP：三磷酸腺苷；Pi：磷酸基團(tuán)圖8 TBI-166發(fā)揮抗結(jié)核作用的可能機(jī)制

本研究局限性在于：(1)TBI-166增強(qiáng)MtbQOR 介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)，可能包含兩個(gè)作用途徑，TBI-166可能被MtbQOR還原，消耗更多的NADPH；也有可能是通過TBI-166與MtbQOR蛋白的活性位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)QOR蛋白的活性從而增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)，但具體的機(jī)制尚需進(jìn)一步的探討。(2)結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)累積一定含量的ROS，可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌DNA損傷，氧化應(yīng)激異常，代謝紊亂，從而導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌死亡[19]，需要進(jìn)一步研究ROS的累積是如何造成結(jié)核分枝桿菌死亡的。