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        抗耐藥結(jié)核病新藥吡法齊明通過醌氧化還原酶介導(dǎo)發(fā)揮作用的機(jī)制研究

        2021-06-02 03:40:34張蕾李媛媛陳曦劉海婷徐建王寧丁楊明陸宇
        中國防癆雜志 2021年6期
        關(guān)鍵詞:耐藥

        張蕾 李媛媛 陳曦 劉海婷 徐建 王寧 丁楊明 陸宇

        結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的,嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳染性疾病,至今仍是造成死亡人數(shù)最多的單一傳染病之一[1]。隨著耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的傳播和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn),強(qiáng)效的一線抗結(jié)核藥品作用受限,而二線抗結(jié)核藥品又存在費(fèi)用高、療程長、治愈率低、不良反應(yīng)大等問題。目前全球結(jié)核病的治愈率為83%,而MDR-TB和XDR-TB的治愈率則僅有54%(中國為41%)和30%[2]?,F(xiàn)有抗結(jié)核藥物不能滿足臨床治療需求,迫切需要具有新作用機(jī)制的抗結(jié)核藥物。

        近年來氯法齊明(clofazimine,Cfz)的抗結(jié)核活性已得到證實(shí),多項(xiàng)含Cfz的短程化療方案均取得了令人矚目的治療效果,2019年的WHO耐多藥或利福平耐藥結(jié)核病治療指南[3]和《中國耐多藥和利福平耐藥結(jié)核病治療專家共識(2019年版)》[4]都把Cfz作為治療耐藥結(jié)核病的核心藥品。但是,Cfz導(dǎo)致的皮膚紅染等不良反應(yīng)使得Cfz的廣泛應(yīng)用受到限制。吡法齊明(pyrifazimine,TBI-166)是在Cfz結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改造獲得的新型亞胺吩嗪類抗結(jié)核藥品,是中國第一個(gè)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗結(jié)核新藥。TBI-166的體外活性更高,且對藥物敏感結(jié)核分枝桿菌、耐藥結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌和非復(fù)制期結(jié)核分枝桿菌均有效[5]。最重要的是,其引起的皮膚染色卻比Cfz少,目前已開展Ⅱ期臨床試驗(yàn)(登記號:CTR20202345),具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

        本課題組對TBI-166的作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討,證實(shí)了TBI-166可能與Cfz有相似的作用機(jī)制,通過累積活性氧(reactive oxygen species,ROS)發(fā)揮殺菌作用[6]。并且利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)量化分析結(jié)核分枝桿菌受到TBI-166作用后蛋白表達(dá)的改變,發(fā)現(xiàn)差異蛋白醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase, QOR;A0A045HJH7)在TBI-166處理組各樣本中均有顯著變化。本研究是利用分子生物學(xué)的方法對MtbQOR蛋白進(jìn)行表達(dá)純化,鑒定TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)的影響,同時(shí)研究了TBI-166處理結(jié)核分枝桿菌后NADPH/NADP+比值的變化以及結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離菌株內(nèi)ROS含量的變化。對TBI-166的抗結(jié)核作用機(jī)制開展進(jìn)一步的探索。

        資料和方法

        一、實(shí)驗(yàn)菌株

        結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC 27294),MDR-TB 患者的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株菌株號為11195及11492(對TBI-166及Cfz耐藥)、12897(對TBI-166及Cfz敏感)、15171(對TBI-166敏感,對Cfz耐藥)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院/北京市耐藥結(jié)核病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供,對TBI-166及Cfz的藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)通過微孔培養(yǎng)顯色法(microplate alamar blue assay,MABA)進(jìn)行測定。

        二、實(shí)驗(yàn)藥物

        TBI-166[純度≥99.0%,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所(北京)黃海洪教授課題組提供]、異煙肼(美國Sigma公司;批號:060M0090;質(zhì)量:50 g;純度≥99.0%)、利福平(RFP;美國Sigma公司;批號:WXBB7288V;質(zhì)量:5 g;純度≥97.0%)。

        三、儀器與試劑

        1.儀器:Infinite 200多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan 公司)、Nuaire701二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國Nuaire 公司)、GENEPRO多功能基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)、DS-11FX超微量分光光度計(jì)(美國DeNovix公司)、Tanon-4200全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、AKTA pure 25蛋白純化系統(tǒng)(美國Gene公司)、SYNERGY酶標(biāo)儀(美國 BIOTEK 公司)、1730R微量高速冷凍離心機(jī)(美國Gene公司)、Max-Q8000低溫?fù)u床(美國Thermo公司)。

        2.試劑:pET32a質(zhì)粒(重慶優(yōu)寶生物技術(shù)股份有限公司;批號:y32014)、BamHⅠ[寶生物工程(大連)有限公司;批號:AHG2027A]、XhoⅠ[寶生物工程(大連)有限公司;批號:AG60621A]、E.coli BL21(DE3)(北京全式金生物技術(shù)有限公司;批號:O20811)、細(xì)菌ROS檢測試劑盒(上海貝博公司;批號:BB20081)、叔丁基過氧化氫(TBHP;美國Sigma公司;批號:SHBB7856V)、輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司;批號:20191223)、菲醌(上海麥克林生化科技有限公司;批號:C10005539)、NADPH(還原型輔酶Ⅱ;上海碧云天生物技術(shù)有限公司;批號:091919201106)。

        四、MtbQOR蛋白表達(dá)與純化

        采用PCR方法從滅活的H37Rv菌株中擴(kuò)增MtbQOR(Rv1454c)基因,并克隆至BamHⅠ和XhoⅠ限制位點(diǎn)之間的pET32a質(zhì)粒,得到的蛋白在MtbQOR的N-末端含有硫氧還蛋白/His6標(biāo)簽,相對分子質(zhì)量約為53 000。MtbQOR在Luria-Bertani培養(yǎng)基(含100 μg/ml氨芐青霉素)大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)生長至對數(shù)生長期(A600 nm達(dá)到0.6),用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h。細(xì)胞在室溫下8000×g離心機(jī)離心15 min,然后在含有25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、pH 8.0的裂解緩沖液中再懸浮和裂解。上清液在12 000×g離心機(jī)離心40 min,得到含有可溶性靶蛋白的上清液加載到Ni柱。靶蛋白使用含有25 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,500 mmol/L咪唑,pH值 8.0的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。將含有蛋白質(zhì)的組分匯集在一起,進(jìn)行濃縮除鹽,并在-80 ℃下儲存至進(jìn)一步使用。通過SDS-PAGE估計(jì)蛋白質(zhì)的純度>95%。

        五、TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)影響

        MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)特異的以NADPH為H+供體,NADPH在波長340 nm下有特異吸收峰,通過酶標(biāo)儀檢測吸光度值(A340 nm)下NADPH下降程度(ΔA)可以反映MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)發(fā)生程度。反應(yīng)在25 ℃,150 mmol/L磷酸鹽緩沖液,pH值7.0,0.12 mmol/L NADPH,0.05 mg/ml MtbQOR,25 μmol/L底物混合體系中測定。通過添加含有MtbQOR蛋白質(zhì)的相同緩沖溶液作為反應(yīng)開始,立即測定波長340 nm下的初始吸光度值A(chǔ)1,在不加入TBI-166或加入不同濃度的TBI-166情況下測定20 min后波長340 nm下的吸光度值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2[7-8]。

        六、結(jié)核分枝桿菌ROS含量測定

        H37Rv菌株和各臨床分離菌株生長至對數(shù)生長期,對H37Rv菌株設(shè)置加TBI-166組(0.03、0.3、3 μg/ml)、加RFP組(0.025、0.25、2.5 μg/ml)、空白對照組及陽性對照組;對各臨床分離菌株設(shè)置加TBI-166組(0.03、0.3、3 μg/ml)、空白對照組及陽性對照組,陽性對照組為TBHP處理組,在藥物作用24 h后進(jìn)行取樣[9]。通過8000×g離心機(jī)離心10 min獲得細(xì)菌培養(yǎng)物并重新懸浮,在O11探針中37 ℃避光孵育30 min。8000×g離心機(jī)離心10 min收集菌體,在磷酸鹽緩沖液中洗滌,并在測量前再次重懸,將200 μl每個(gè)樣品裝入黑色底部透明96孔板中。設(shè)置激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長526 nm檢測熒光值。

        七、結(jié)核分枝桿菌NADPH/NADP+比值測定

        采用輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測試劑盒對結(jié)核分枝桿菌NADPH/NADP+比值進(jìn)行測定。H37Rv菌株生長至對數(shù)生長期,設(shè)置加TBI-166組(0.03、0.3、3 μg/ml)及空白對照組,在藥物作用6、12、24、48、96 h后進(jìn)行取樣。通過8000×g離心機(jī)離心10 min 獲得細(xì)菌培養(yǎng)物,分別用酸性和堿性提取液提取結(jié)核分枝桿菌中的NADP+和NADPH。NADPH通過PMS的遞氫作用,可以使氧化型噻唑藍(lán)(MTT)還原為甲瓚,使用酶標(biāo)儀在波長570 nm下檢測吸光度值。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP+為NADPH,從而檢測NADP+含量。進(jìn)而計(jì)算兩者比值。

        八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        結(jié) 果

        一、MtbQOR蛋白表達(dá)、純化

        對經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌株BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c進(jìn)行SDS-PAGE分析,在相對分子質(zhì)量約53 000處出現(xiàn)目的蛋白條帶,而菌株BL21(DE3)及空載菌株BL21(DE3)-pET32a無此條帶(圖1),表明Rv1454c基因在大腸桿菌中得到了成功表達(dá)。目的蛋白在細(xì)菌裂解上清和包涵體均有表達(dá),收集上清用Ni-NTA親和純化柱純化目的蛋白,通過Western Blot確定是目的蛋白(圖2)并且通過SDS-PAGE確定得到的蛋白純度>95%(圖3)。

        注 M:蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);l:BL21(DE3)全菌;2:不含目的蛋白重組BL21(DE3)-pET32a全菌;3:上樣緩沖液;4:未誘導(dǎo)重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌;5:誘導(dǎo)2 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌;6:誘導(dǎo)4 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌;7:誘導(dǎo)16 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌;8: 誘導(dǎo)18 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌圖1 重組蛋白Rv1454c的SDS-PAGE電泳分析

        注 M:蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:Ni-NTA純化后的Rv1454c蛋白圖2 Ni-NTA純化后的Rv1454c蛋白Western Blot驗(yàn)證

        注 M:蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:Ni-NTA純化后的Rv1454c蛋白圖3 純化的重組蛋白Rv1454c SDS-PAGE電泳分析

        二、MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)監(jiān)測

        隨著加入TBI-166濃度的增高,NADPH下降的程度(ΔA)更大。與空白對照組ΔA(0.316±0.032)比較,0.03、0.3、3 μg/ml TBI-166組ΔA(0.506±0.107、0.531±0.054、0.801±0.079)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.799,P<0.05;t=-7.634,P<0.01;t=-12.683,P<0.01) (圖4)。

        注 ΔA為波長340 nm下NADPH吸光度的下降程度, a:P<0.05,b:P<0.001圖4 不同濃度TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)影響

        注 A~E圖分別是不同濃度TBI-166作用6、12、24、48及96 h的NADPH/NADP+比值圖5 不同濃度TBI-166作用H37Rv不同時(shí)間NADPH/NADP+比值

        三、不同濃度TBI-166作用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株后NADPH/NADP+比值測定

        不同濃度TBI-166作用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株后分別對作用6、12、24、48、96 h的NADPH/NADP+的比值進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示(圖5),在6、12、24及48 h與同一檢測時(shí)間點(diǎn)空白對照組相比,加入TBI-166藥物的各處理組NADPH/NADP+的比值均降低,空白組的NADPH/NADP+的比值為1.728±0.384,而加TBI-166組的NADPH/NADP+比值為0.847±0.229。并且,隨著作用時(shí)間的延長,NADPH/NADP+的比值逐漸降低,在TBI-166作用48 h之后,NADPH/NADP+的比值達(dá)到最低,而在96 h,各TBI-166組的NADPH/NADP+的比值上升接近空白對照組的比值(圖6)。

        圖6 不同濃度TBI-166作用H37Rv后NADPH/NADP+比值隨時(shí)間變化曲線

        注 A:不同濃度TBI-166作用H37Rv 24 h后ROS熒光值;B:不同濃度RFP作用H37Rv 24 h后ROS熒光值;C:不同濃度TBI-166作用菌株12897 24 h后ROS熒光值;D:不同濃度TBI-166作用菌株15171 24 h后ROS熒光值;E:不同濃度TBI-166作用菌株11492 24 h后ROS熒光值;F:不同濃度TBI-166作用菌株11195 24 h后ROS熒光值,a:P<0.05,b:P<0.01,c:P<0.001圖7 不同濃度TBI-166刺激各菌株24 h菌體ROS熒光值

        四、不同濃度TBI-166刺激結(jié)核分枝桿菌各菌株后的菌體細(xì)胞ROS含量測定

        TBI-166刺激H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株及各臨床分離株后的菌體細(xì)胞熒光強(qiáng)度值在刺激24 h后達(dá)到最大,記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)。在H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株中,TBI-166刺激組ROS熒光值為23 072±2584,明顯高于空白對照組(8282±448),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.334,P<0.01)。不同濃度的RFP刺激均不能引起ROS的上升(圖7A~B),與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=261.392,P>0.05)。在菌株號為12897菌株中,TBI-166刺激組ROS熒光值為18 369±3118,明顯高于空白對照組(12 268±2735)(圖7C),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.026,P<0.05)。在菌株號為15171菌株中,0.03、0.3 μg/ml TBI-166刺激菌體ROS含量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=122.601,P>0.05),3 μg/ml TBI-166刺激組ROS熒光值為17 572±249,明顯高于空白對照組(11 109±343)(圖7D),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.601,P<0.01)。菌株號為11492及11195菌株,在這兩株菌中,TBI-166刺激組與空白對照組相比熒光值接近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=161.440,P>0.05;F=44.788,P>0.05),而陽性對照TBHP組可以明顯刺激菌體產(chǎn)生ROS(圖7E~F),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=161.440,P<0.01;F=44.788,P<0.01)。

        討 論

        TBI-166是Cfz的結(jié)構(gòu)改造物,在臨床前研究中,展現(xiàn)了與Cfz相當(dāng)?shù)目菇Y(jié)核活性,并且降低皮膚紅染不良反應(yīng)[10]。在比格犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究表明其屬于低清除率藥物[11]。在BALB/c小鼠中,與對照方案INH+RFP+PZA相比,5種含TBI-166的方案在治療4周后顯示出更好的療效[12]。最新一項(xiàng)研究表明,每日一次給予TBI-166比間歇給藥方案更有效[13],TBI-166擁有替代Cfz進(jìn)入臨床治療的潛能。本研究對抗耐藥結(jié)核新藥TBI-166通過MtbQOR介導(dǎo),累積ROS的機(jī)制進(jìn)行探討,為TBI-166 Ⅱb期臨床試驗(yàn)的組合方案提供合理充分的理論依據(jù)。

        MtbQOR為醌氧化還原酶,以NADPH為H+供體,介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)過程中會生成活性氧自由基,包括超氧陰離子、過氧化物和羥自由基[14]。本研究發(fā)現(xiàn)加入不同濃度的TBI-166均可以增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)的還原反應(yīng),3 μg/ml TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原中NADPH下降程度是空白對照組的2.5倍,0.03、0.3 μg/ml TBI-166對MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原中NADPH下降程度是空白對照組的1.6、1.7倍。Cfz是具有氧化還原活性的分子,其可在NDH-2醌氧化還原酶的作用下被還原,生成活性還原型Cfz,接著還原型Cfz在O2的作用下生成活性氧物質(zhì),通過累積ROS發(fā)揮抗結(jié)核作用[15]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)TBI-166可以增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng),因此推測,TBI-166 與MtbQOR的底物醌競爭電子被還原,被還原后的TBI-166隨后氧化并產(chǎn)生超氧化物和過氧化氫之類的ROS發(fā)揮作用。

        NADPH是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成成分,在細(xì)胞防御ROS損傷方面起著重要的作用,NADPH的氧化形式是NADP+,測定結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)的NADPH/NADP+比值一方面可以反映菌體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)[16],另一方面代表MtbQOR催化反應(yīng)的發(fā)生方向。在本研究中,測定不同濃度TBI-166處理H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株后顯示TBI-166可以降低結(jié)核分枝桿菌內(nèi)NADPH/NADP+的比值,證實(shí)結(jié)核分枝桿菌內(nèi)反應(yīng)向著消耗NADPH,生成NADP+的方向進(jìn)行,結(jié)核分枝桿菌受到TBI-166作用后,菌體內(nèi)氧化還原水平活躍,提示MtbQOR的還原反應(yīng)活躍,這與TBI-166增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)研究結(jié)果一致。并且我們發(fā)現(xiàn)在96 h NADPH/NADP+比值在TBI-166處理組與空白對照組接近,這可能與TBI-166作用后結(jié)核分枝桿菌的代謝代償有關(guān),經(jīng)過藥物處理后的結(jié)核分枝桿菌為了抵抗TBI-166的作用,經(jīng)過代償活動,產(chǎn)生更多的NADPH,在96 h使得NADPH/NADP+的比值恢復(fù)到正常水平。

        結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌體內(nèi)ROS的含量在TBI-166作用24 h后有顯著的變化,與空白對照組相比有2倍左右的上升,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的RFP作用H37Rv菌株后并不能引起ROS含量的變化,這與RFP可能具有抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)[17],提示結(jié)核分枝桿菌內(nèi)ROS的累積可能是TBI-166特異性發(fā)揮作用的途徑。此結(jié)論在結(jié)核分枝桿菌臨床株中得到證實(shí),對TBI-166 耐藥的菌株(11492、11195)中均不能觀察到ROS含量的上升,而TBI-166敏感的菌株中(12897)觀察到與H37Rv相似的結(jié)果。

        值的注意的是,本研究發(fā)現(xiàn)3 μg/ml TBI-166增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)明顯高于0.03、0.3 μg/ml TBI-166,而不同濃度TBI-166作用H37Rv后NADPH/NADP+的比值接近,提示0.03、0.3 μg/ml TBI-166作用結(jié)核分枝桿菌后可能不僅通過MtbQOR途徑消耗NADPH,還存在其他消耗NADPH的方式。在ROS實(shí)驗(yàn)中,筆者觀察到菌株15171中,0.03、0.3 μg/ml TBI-166對菌體ROS的刺激作用較3 μg/ml TBI-166弱,進(jìn)一步分析菌株15171對Cfz耐藥,提示0.03、0.3 μg/ml TBI-166與Cfz的作用機(jī)制存在交叉部分。NDH-2貢獻(xiàn)電子是結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈的起始,Cfz通過競爭NDH-2貢獻(xiàn)電子累積ROS而影響結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈[15, 18],NADPH可以提供H給NAD+生成NADH參與氧化呼吸鏈的H傳遞[9]。因此推測0.03、0.3 μg/ml TBI-166可能通過降低NADPH的相對含量,使得NADPH提供給NAD+的H變少,進(jìn)而使進(jìn)入氧化呼吸鏈的NADH含量變少,發(fā)揮抗結(jié)核作用。

        根據(jù)本研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)TBI-166增強(qiáng)MtbQOR 介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng),累積ROS發(fā)揮抗結(jié)核作用,并且可能通過降低NADPH/NADP+的比值,降低NADPH的相對含量影響結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈(圖8)。TBI-166的抗結(jié)核作用機(jī)制研究,將進(jìn)一步充實(shí)和豐富吩嗪類藥物抗結(jié)核作用機(jī)制的理論依據(jù);為其后期的臨床合理組合用藥提供理論依據(jù);對新型藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及新型抗生素的研發(fā)具有一定的潛在借鑒和應(yīng)用價(jià)值,對將來臨床分子診斷等具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

        注 O2:氧;ROS:活性氧;QOR:醌氧化還原酶;TBI-166red:還原型TBI-166;TBI-166ox:氧化型TBI-166;NADPH:還原型輔酶Ⅱ;NADP+:氧化型輔酶Ⅱ;Electron Transport Chain:電子呼吸鏈;NADH:還原型輔酶Ⅰ;NAD+:氧化型輔酶Ⅰ;ADP:二磷酸腺苷;ATP:三磷酸腺苷;Pi:磷酸基團(tuán)圖8 TBI-166發(fā)揮抗結(jié)核作用的可能機(jī)制

        本研究局限性在于:(1)TBI-166增強(qiáng)MtbQOR 介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng),可能包含兩個(gè)作用途徑,TBI-166可能被MtbQOR還原,消耗更多的NADPH;也有可能是通過TBI-166與MtbQOR蛋白的活性位點(diǎn)結(jié)合,增強(qiáng)QOR蛋白的活性從而增強(qiáng)MtbQOR介導(dǎo)氧化還原反應(yīng),但具體的機(jī)制尚需進(jìn)一步的探討。(2)結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)累積一定含量的ROS,可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌DNA損傷,氧化應(yīng)激異常,代謝紊亂,從而導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌死亡[19],需要進(jìn)一步研究ROS的累積是如何造成結(jié)核分枝桿菌死亡的。

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