蔡 行 ，石 建 ，喻恒軍 ，馮 靜 ，陳 娟 ，謝 惠 ，喻正軍 *

（1.湖南國(guó)測(cè)生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.湖南中凈生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

非洲豬瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）是一類(lèi)古老的病毒，早在1921年在非洲肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)，至今有約100年的歷史。非洲豬瘟（African swine fever，ASF）即是由非洲豬瘟病毒引起的家豬、野豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，所有品種和年齡的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率高，可達(dá)100%[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，中國(guó)也將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。ASF 最早于1921年在非洲肯尼亞被發(fā)現(xiàn)，1957年傳入歐洲，1971年傳入加勒比海地區(qū)和南美洲，2007年傳入高加索地區(qū)，現(xiàn)仍在非洲、南撒丁島和高加索地區(qū)流行，給世界各國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。2018年8月3日，中國(guó)確診首例非洲豬瘟疫情，之后不斷蔓延，2020年4月19日，海南報(bào)道非洲豬瘟疫情后，我國(guó)內(nèi)地31個(gè)省份，已全部發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情。

目前尚無(wú)有效的疫苗對(duì)非洲豬瘟進(jìn)行防控，各地養(yǎng)殖場(chǎng)需依賴(lài)生物安全措施，并組建快速診斷實(shí)驗(yàn)室，使用高精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，對(duì)進(jìn)出入豬場(chǎng)物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。該研究旨在通過(guò)比對(duì)不同廠家的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒的主要性能，為豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室提供科學(xué)的試劑盒選擇方案，幫助豬場(chǎng)合理選擇試劑盒，構(gòu)筑穩(wěn)固的生物安全檢測(cè)防線，阻擊非洲豬瘟的入侵。

1 材料與方法

1.1 試劑盒與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

4種商品化的非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，A廠家試劑盒（非預(yù)混型）批次342020005，B廠家試劑盒（非預(yù)混型）批次202006，C廠家試劑盒（預(yù)混型）批次20191118，D廠家試劑盒（預(yù)混型）批次20200301；B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品GBW（E）091034（批號(hào)：2020001）購(gòu)自中國(guó)牧工商集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀SLAN-48P購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 線性擴(kuò)增試驗(yàn)

將B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1 000 copies/μL、100 copies/μL、20 copies/μL、4 copies/μL、0.8 copies/μL，共5個(gè)稀釋度，使用4種試劑盒，按照其說(shuō)明書(shū)配置PCR體系，進(jìn)行熒光 PCR 檢測(cè)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3 次，同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照。分析各試劑盒對(duì)不同梯度核酸檢測(cè)Ct值，比較不同試劑盒對(duì)各稀釋度的檢出率和變異系數(shù)。

1.3.2 敏感性試驗(yàn)

將B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至20 copies/μL，使用4種試劑盒對(duì)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光 PCR 擴(kuò)增，每種試劑盒重復(fù)檢測(cè)48個(gè)孔，統(tǒng)計(jì)該拷貝數(shù)下不同試劑盒的檢出率。

1.3.3 假陽(yáng)性檢測(cè)試驗(yàn)

使用純化水做無(wú)模板陰性對(duì)照，每種試劑盒配置46個(gè)陰性反應(yīng)，設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照。統(tǒng)計(jì)不同試劑盒出現(xiàn)假陽(yáng)性的次數(shù)，假陽(yáng)性概率最低者為佳。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性擴(kuò)增結(jié)果

使用純水做無(wú)模板陰性，每種試劑盒配置46個(gè)陰性反應(yīng)，設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，統(tǒng)計(jì)不同試劑盒出現(xiàn)假陽(yáng)性（有Ct值且曲線不典型）的次數(shù)，A試劑盒未檢到陽(yáng)性，B試劑盒未檢測(cè)到陽(yáng)性，C試劑盒檢測(cè)2個(gè)非特異性陽(yáng)性反應(yīng)，D試劑盒檢測(cè)到1個(gè)非特異性陽(yáng)性反應(yīng)，具體結(jié)果見(jiàn)圖2與表4。

使用4種試劑盒對(duì)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，4種試劑盒在1 000 copies/μL、100 copies/μL兩種拷貝數(shù)的檢出率均為100%，在拷貝數(shù)稀釋至20 copies/μL時(shí)出現(xiàn)檢出率的差異：A試劑盒的檢出率為100%（3/3），B試 劑：檢 出 率為33.33%（1/3），C試劑盒的檢出率為33.33%（1/3），D試劑盒的檢出率為66.67%（2/3）。A試劑盒在20 copies/μL的檢出率高于其他試劑盒，具體結(jié)果見(jiàn)表1與表2。

表1 4種非洲豬瘟核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)Ct值

表2 4種非洲豬瘟核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)Ct值的變異系數(shù)

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

使用4種試劑盒對(duì)稀釋至20 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示A試劑盒的檢出率最高為91.67%（44/48），B試劑盒的檢出率次之為85.42%（41/48），C試劑盒的檢出率為79.17%（38/48），D試劑盒的檢出率為58.33%（28/48），具體結(jié)果見(jiàn)圖1與表3。

圖1 4種試劑盒敏感性試驗(yàn)

表3 4種非洲豬瘟核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)20 copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果

2.3 假陽(yáng)性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

該研究比較了4個(gè)廠家生產(chǎn)的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒對(duì)B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示：線性擴(kuò)增試驗(yàn)中，A試劑盒對(duì)20 copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢出率為100%（3/3），其他試劑盒對(duì)該濃度下的標(biāo)準(zhǔn)品的檢出率均未達(dá)到100%；敏感性試驗(yàn)中，A試劑盒對(duì)稀釋至 20 copies/μL的48個(gè)重復(fù)，檢出率為91.67%（44/48）,其他試劑盒的檢出率分別為85.42%（41/48）、79.17%（38/48）、58.33%（28/48）；假陽(yáng)性試驗(yàn)中，A試劑盒和B試劑盒，未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，C、D試劑盒分別出現(xiàn)2、1個(gè)非特異陽(yáng)性反應(yīng)。綜合3個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，A試劑盒在不同稀釋濃度下的檢出率、低濃度（20 copies/μL）的檢出率、假陽(yáng)性出現(xiàn)頻次上領(lǐng)先其他試劑盒，更符合豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于高敏感性和低假陽(yáng)性的需求，可以應(yīng)用于豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒的核酸診斷。

圖2 4種試劑盒假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果

表4 4種非洲豬瘟核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)純水的檢測(cè)結(jié)果

非洲豬瘟病毒對(duì)腐敗、溫度、干燥及消毒劑都具有較強(qiáng)的抵抗力。在適宜的蛋白質(zhì)環(huán)境下，非洲豬瘟病毒可在較大的溫度范圍和pH范圍內(nèi)存活，在血液、尿、糞中非常穩(wěn)定，能長(zhǎng)時(shí)間存活于經(jīng)加工過(guò)的豬肉制品中［3］。由于ASFV在環(huán)境中穩(wěn)定、存活時(shí)間長(zhǎng)，生物安全是防控該病毒的唯一方案，進(jìn)入豬場(chǎng)的物質(zhì)和人員必須進(jìn)行執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全洗消，并進(jìn)行核酸檢測(cè)。選擇一款敏感性高、假陽(yáng)性少的試劑盒，能大大提升豬場(chǎng)生物安全牢固程度。

試劑盒的敏感性較低，可能與引物和探針序列、試劑盒生產(chǎn)工藝相關(guān)。在臨床檢測(cè)過(guò)程中，檢出率偏低除與試劑盒敏感性有關(guān)外，還可能與樣本復(fù)雜程度、樣本采集運(yùn)輸、樣本核酸提取等各種因素相關(guān)；實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)假陽(yáng)性，可能與試劑盒不穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)室污染、設(shè)備的閾值線設(shè)定等方面相關(guān)，豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室需要綜合各方面的因素進(jìn)行判斷，該研究中C、D試劑盒為預(yù)混裝，產(chǎn)生的假陽(yáng)性可能與試劑預(yù)混后，發(fā)生非特異性反應(yīng)有關(guān)。

該研究?jī)H對(duì)4個(gè)廠家試劑某一批號(hào)的檢測(cè)能力做了簡(jiǎn)要比較分析，樣本量有限，并不能代表各試劑的整體檢測(cè)性能，僅作為一種試劑盒比對(duì)方案，供豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室參考，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力除與試劑盒相關(guān)性能相關(guān)外，還需要實(shí)驗(yàn)室的操作人員嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作流程，執(zhí)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，避免因操作原因引起的假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果。