萬偉偉 龍洋 劉宏卓 萬文萃

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，糖尿病患者中DR患病率高達51.3%，是工作年齡階段失明的主要原因[1-2]。目前現(xiàn)有的診治手段不能有效避免DR的進展，早期篩查在DR的診治中具有重要的意義。生物標志物現(xiàn)已被用于各種疾病的診斷和分類中，包括糖尿病和DR[3]。褪黑素是一種內(nèi)源性吲哚胺類物質(zhì)，由松果體和部分視網(wǎng)膜合成，具有抗氧化和抗凋亡作用，與多種代謝性疾病有關(guān)，對腦、心、肝等重要器官具有保護作用。有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在DR的治療中具有潛在的作用[4-5]。目前，國內(nèi)外有關(guān)血漿褪黑素濃度與DR相關(guān)性研究很少見。因此，本研究通過檢測2型糖尿病患者血漿中褪黑素濃度，旨在分析其與DR的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用前瞻性病例對照研究。收集2020年5月至10月于鄭州大學第一附屬醫(yī)院篩查糖尿病者300人。其中，體檢確認無糖尿病者118人為對照組，確診為2型糖尿病并于眼科就診的182例患者為研究組。將研究組患者再分為無DR組(NDR組 57例)、非增生型DR組(NPDR組 64例)和增生型DR組(PDR組 61例)。2型糖尿病的診斷依據(jù)2019年美國糖尿病協(xié)會(American Diabetes Association,ADA )標準[6]。根據(jù)眼底照相及裂隙燈檢查對DR進行診斷和分類，依據(jù)2019年美國眼科學會《糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床指南》進行分級。納入標準：(1)健康對照或2型糖尿病伴或不伴DR;(2)能夠配合科研活動;(3)研究前簽署知情同意書。排除標準:(1)診斷為1型糖尿病;(2)精神障礙或嚴重睡眠障礙患者;(3)近2周口服褪黑素補充者。本研究經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批文號：2020-KY-395)，所有受試者在研究前均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料與生化指標獲取方法通過咨詢受試者獲得所有研究對象基本資料，如年齡、糖尿病病程、高血壓史、吸煙史、飲酒史等。根據(jù)體質(zhì)量計算每名研究對象體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。生化指標：如甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血清總膽紅素(Tb)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(Hcy)、25羥基維生素D3[25(OH)VitD3]和甲狀旁腺激素(PTH)，從院內(nèi)檢查系統(tǒng)中提取。DR的診斷由兩名眼科專家結(jié)合眼底照相及眼底檢查進行獨立診斷，并在進一步分析前行一致性檢查。

1.2.2 血樣采集與褪黑素濃度檢測收集對照組、NDR組、NPDR、PDR組所有研究對象早晨800血液樣本2 mL，靜脈血標本置于裝有乙二胺四乙酸(EDTA)的試管中，置于冰上，4 ℃ 3000 r·min-1離心15 min獲得血漿標本。使用前將所有血漿樣本放入凍存管(1.5 mL)，-80 ℃保存。為測定血漿中褪黑素的濃度，樣品采用人褪黑素酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Glory Science Co.， Ltd，TX，美國)進行檢測。每個樣本檢查3次，取其平均值將用于最終的數(shù)據(jù)分析。分析評估兩組研究對象間基本資料的可比性，測量并記錄各組研究對象血漿褪黑素濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用配對t檢驗，三組以上差異檢測采用單因素方差分析。定性資料比較采用卡方檢驗。采用受試者特征曲線(ROC)檢驗相關(guān)指標的有效性。Spearman分析褪黑素濃度與其他各檢測指標的相關(guān)性，Logistic 回歸分析NPDR及PDR可能的危險因素。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料及生化指標比較各組研究對象間性別分布差異無統(tǒng)計學意義(P=0.947)；而對照組、NDR組、NPDR組、PDR組研究對象年齡比較，NPDR組、PDR組患者年齡均大于對照組(均為P<0.001)。各組研究對象間BMI差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)，SBP、DBP和MAP差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)，而PDR組患者高血壓患病率較高。NDR組、NPDR組、PDR組患者糖尿病病程、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1C)含量比較，差異也均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.001)。各組研究對象間TG、TC、LDL-C、HDL-C和PTH差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。此外，各組研究對象間Tb、hs-CRP、Hcy及25(OH)VitD3差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表1)。

表1 各組一般資料及生化指標比較

2.2 血漿褪黑素水平與DR的相關(guān)性分析對照組、NDR組、NPDR組及PDR組人員血漿褪黑素濃度分別為(72.83±16.25)ng·L-1、(60.38±13.43)ng·L-1、(44.48±10.30)ng·L-1和(44.69±8.95)ng·L-1，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與對照組相比，NDR組患者血漿褪黑素濃度較低(P<0.001)。與NDR組相比，NPDR組和PDR組患者血漿褪黑素濃度較低(P< 0.001)。通過ROC曲線分析檢測血漿褪黑素濃度對DR的診斷作用，發(fā)現(xiàn)血漿褪黑素濃度可作為潛在的診斷DR的生物標志物(AUC=0.893，P<0.001)，且cut off為0.685時敏感度為0.896、特異度為0.789(見圖1A)；通過分析NPDR組、PDR組、NDR組的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)血漿褪黑素水平對糖尿病患者中DR的診斷作用，cut off為0.593時敏感度為0.856、特異度為0.737(見圖1B)；與對照組相比可發(fā)現(xiàn)血漿褪黑素濃度對診斷DR患者具有很高的敏感度和特異度(見圖1C、D、E)。

圖1 各組血漿褪黑素水平及ROC曲線 A:NPDR組+PDR組 vs NDR組+對照組的ROC曲線，cut off為0.685時敏感度為0.896、特異度為0.789；B:NPDR組+PDR組 vs NDR組的ROC曲線，cut off=0.593時敏感度為0.856、特異度為0.737；C:NPDR組vs對照組的ROC曲線，cut off為0.738時敏感度為0.891、特異度為0.847；D:PDR組vs對照組的ROC曲線，cut off為0.773時敏感度為0.934、特異度為0.839；E:NPDR組+PDR組vs對照組的ROC曲線，cut off為0.751時敏感度為0.912,特異度為0.839。

2.3 DR患者生化指標與NPDR/PDR風險的相關(guān)性分析為了分析不同分期DR的生化指標危險因素，本研究進一步分析了FBG濃度、HbA1C含量、血清Tb、血漿褪黑素濃度、hs-CRP、Hcy、25(OH)VitD3、PTH與NPDR/PDR發(fā)病風險的相關(guān)性。結(jié)果顯示，較高的hs-CRP、FBG和較低的褪黑素濃度、25(OH)VitD3均與NPDR風險增加相關(guān)(均為P<0.001)；在對PDR風險檢測的進一步分析中發(fā)現(xiàn)，較高的HbA1C含量、hs-CRP和較低的25(OH)VitD3是PDR的危險因素(均為P<0.001)(見表2)。

表2 生化指標和NPDR/PDR風險之間的多因素Logistic回歸分析

2.4 生化指標與血漿褪黑素濃度的相關(guān)性血漿褪黑素濃度可作為DR診斷的特異性指標，進一步研究生化指標與血漿褪黑素濃度之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，PTH與血漿褪黑素濃度無相關(guān)性(r=0.014,P=0.808)；FBG、HbA1C含量、hs-CRP和Hcy與血漿褪黑素濃度均呈負相關(guān)(r=-0.464、-0.481、-0.663、-0.607,均為P<0.001)；血清Tb、25(OH)VitD3與血漿褪黑素濃度均呈顯著正相關(guān)(均為P<0.001)(見表3)。

表3 生化指標與血漿褪黑素濃度的相關(guān)性

2.5 血清Tb和褪黑素濃度之間的關(guān)系基于血清Tb和褪黑素濃度之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，在不同組別中對這一關(guān)系進行了更深入研究，結(jié)果顯示：在所有受試者中，血清Tb和褪黑素濃度之間存在顯著的線性相關(guān)(R2=0.438，P<0.001)?？紤]到不同的DR分期，NPDR組和PDR組患者血清Tb與褪黑素濃度之間存在顯著相關(guān)性(R2=0.360、0.183，均為P<0.001)(見圖2)。

圖2 各組受試者血清Tb與血漿褪黑素濃度的線性關(guān)系 A:所有受試者血清Tb與血漿褪黑素濃度的線性分析;B:NPDR組患者血清Tb與血漿褪黑素濃度的線性分析;C:PDR組患者血清Tb與血漿褪黑素濃度的線性分析。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)對照組與研究組對象間血漿褪黑素濃度不同，并且與對照組和NDR組相比，NPDR組和PDR組患者血漿褪黑素濃度明顯降低。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)血漿褪黑素濃度對DR的診斷效果具有高度敏感性和特異性。因此可以認為：血漿褪黑素可以作為DR的靈敏度較高的診斷標志物。本研究相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，對照組和研究組受試者血清Tb與血漿褪黑素濃度呈正相關(guān)。hs-CRP的增高和25(OH)VitD3的降低均與DR的進展有關(guān)。各組研究對象間Hcy的差異具有統(tǒng)計學意義，但與DR患病風險的研究中無明顯的相關(guān)性。另外，PTH與DR的患病風險無明顯的相關(guān)性。

生物標志物在DR診斷中的價值越來越引起人們的重視，國內(nèi)有報道稱衰老標記蛋白30的降低與DR的進展有關(guān)，并可作為DR早期的干預靶點[7]。Platania等[8]的研究中一組miRNA被確定為DR的潛在診斷標記物。有報道稱中國2型糖尿病患者的血清CA125水平與DR的存在和嚴重程度相關(guān)[9]。以上研究為診斷DR生物標志物的開發(fā)提供了可行性保障。褪黑素作為一種對哺乳動物生物節(jié)律起重要調(diào)節(jié)作用的激素被大家所熟知[10]。有研究表明，褪黑素具有重要的調(diào)節(jié)作用，并進一步預防各種疾病，包括心血管疾病、神經(jīng)血管疾病和糖尿病，包括繼發(fā)于糖尿病的并發(fā)癥[11]。也有研究表明PDR患者褪黑素分泌減少[12]，因為褪黑素作為抗氧化劑/線粒體保護因子和炎癥因子，可能導致DR的進展。本研究與此不一致的是，與對照組和NDR組相比，NPDR組患者血漿褪黑素濃度降低。這可能因為本研究的樣本量相比以上研究較大，ELISA檢測方法可能導致兩項研究結(jié)果差異。

本研究中所有受試者血清Tb與血漿褪黑素濃度呈顯著正相關(guān)。膽紅素是由血紅素分解代謝產(chǎn)生的，研究發(fā)現(xiàn)其對血管具有抗炎和抗氧化作用[13]。國內(nèi)有研究認為[14]，在2型糖尿病患者中，女性的Tb水平與DR的患病風險存在U形關(guān)系，而男性患者Tb水平與DR的患病風險存在負相關(guān)關(guān)系[15]。Zhu等[16]在一項基于1637位受試者的橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)，DR患者的血清Tb水平明顯低于2型糖尿病患者。還有學者認為，較高水平的Tb對DR具有保護作用。膽紅素和褪黑素在DR的進展中生理作用相似，這可能是二者之間呈正相關(guān)的原因。在血漿褪黑素濃度的Spearman分析中還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BG、HbA1C、hs-CRP、Hcy與血漿褪黑素濃度均呈負相關(guān)關(guān)系，而25(OH)VitD3與血漿褪黑素濃度呈正相關(guān)。國內(nèi)外有研究表明hs-CRP是一種主要由肝臟合成的蛋白質(zhì)，提示其是全身性炎癥反應(yīng)急性期的非特異性標志物，可加速DR的進展[17-18]。Hcy是一種血管損傷性氨基酸，可以充分反映血管病變情況，且與2型糖尿病患者血管病變有一定相關(guān)性[19-20]。Alcubierre等[21]研究發(fā)現(xiàn)，25(OH)VitD3濃度與DR相關(guān)，且濃度越低DR的進展越嚴重。本研究結(jié)果與其相符，且進一步證明了血漿褪黑素濃度是診斷DR的敏感指標。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DR患者血漿褪黑素濃度降低，血漿褪黑素可作為診斷DR的敏感、特異指標，血清Tb與褪黑素濃度呈顯著正相關(guān)，而hs-CRP、Hcy與血漿褪黑素濃度均呈負相關(guān)關(guān)系，而25(OH)VitD3與血漿褪黑素濃度呈正相關(guān)。本研究的局限性在于納入樣本量小和未進行長期的隨訪。此外，褪黑素的分泌具有晝夜節(jié)律性，本研究中所有受試者只選擇了一個標準時間點，接下來的研究中我們將進一步檢測更多的時間點，以利于測量褪黑素分泌的晝夜節(jié)律；同時進行合理的研究設(shè)計并構(gòu)建動物模型，進一步探究褪黑素對DR的保護作用及具體的分子機制。