曹永成， 曹瑞雪， 房 磊， 陳 鑫， 姜貝貝， 張建平， 劉曉紅

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院1.病理科；2.肝膽外科，山東 濟南 250031；3.山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 病理科，山東 濟南 250014

肝癌是臨床較常見的癌癥之一，其預(yù)后較差，5年存活率極低[1]。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是一種富含半胱氨酸的細胞基質(zhì)蛋白，具有促進細胞有絲分裂、增殖、粘附、遷移和促進細胞外基質(zhì)(extracellar matrix，ECM)合成等多種生物學功能，參與體內(nèi)血管再生、疤痕形成、器官纖維化及腫瘤生長等多種病理生理過程[2-4]。有研究表明，CTGF在肝癌組織中呈高表達，其可促進肝癌實質(zhì)細胞增殖、遷移、浸潤，在肝癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[5-6]。miR-133b是miRNA家族成員之一，在胃癌、非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌中均呈異常低表達狀態(tài)，參與調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展進程，但其在肝癌中的表達變化情況尚不清楚[7-9]。有研究顯示，CTGF是miR-133b靶基因之一，推測miR-133b可能通過調(diào)節(jié)CTGF表達變化影響肝癌發(fā)生、發(fā)展[10]。因此，本研究通過分析肝癌組織及細胞中miR-133b表達情況，旨在探討miR-133b在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 收集2016—2018年經(jīng)病理證實為肝癌病變組織標本106例納入肝癌組織組，同時收集其相應(yīng)癌旁組織(距離癌灶邊緣>2 cm)標本納入癌旁組織組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有標本采集均經(jīng)患者簽署知情同意。細胞株：永生化人正常肝細胞系LO2；人肝癌細胞系HB-611、BEL-7402、Hep3b、SMMC-7721和HepG2細胞。上述細胞株均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；青霉素(美國HyClone公司)；鏈霉素(美國HyClone公司)；miScript Plant PT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN公司)；實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)反應(yīng)試劑盒(北京天根公司)；CTGF抗體(1∶500稀釋，美國Proteintech公司)，GAPDH抗體(1∶1 000稀釋，美國Proteintech公司)；lip2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；mimic-133b(上海吉瑪公司)；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(北京索萊寶公司)；結(jié)晶紫染色液(北京索萊寶公司)。ABI PRISM 7500定量PCR擴增儀(美國ABI公司)；奧德賽掃膜成像儀(美國Licor公司)；酶標儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 實時定量PCR檢測miR-133b表達 四氯化碳法提取肝癌、癌旁組織或肝癌細胞及正常肝細胞的總RNA，檢測RNA純度及完整性。應(yīng)用miScript Plant PT Kit試劑盒進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后進行實時定量PCR反應(yīng)，U6為內(nèi)參，反應(yīng)模式為預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 15 s；退火60℃ 20 s；延伸95℃ 5 s，共40個循環(huán)。每個樣本和基因同時做3個復(fù)孔，輸出數(shù)據(jù)為復(fù)孔Ct值的平均值，統(tǒng)計分析時采用2-△△Ct計算法檢測miR-133b的相對表達水平。miR-133b的上游引物序列為5′-CTTTGGTCCCCTTCAACCA-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 免疫印跡法檢測CTGF蛋白表達 RIPA組織裂解液提取研磨組織蛋白或RIPA裂解細胞提取細胞總蛋白。采用BCA法進行蛋白定量，每個上樣孔的上樣量為25 μg，配制電泳凝膠，蛋白變性，十二脘基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrohoresis，SDS PAGE)，濕法轉(zhuǎn)膜，PVDF膜于5%牛奶封閉1 h，4℃下一抗(CTGF抗體)孵育過夜，洗膜，熒光二抗室溫孵育2 h，洗膜，掃膜成像，取GAPDH為內(nèi)參。應(yīng)用Image-Pro Plus 6軟件，對圖像進行灰度測定，計算各條帶與對應(yīng)GAPDH的灰度比。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 于37℃水浴鍋中融化凍存管中肝癌細胞，加入適量細胞生長液(5%FBS，0.1 mg/ml鏈霉素，100 U/ml青霉素，DMEM培養(yǎng)基)懸浮細胞并接種于細胞培養(yǎng)瓶中。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，細胞融合度為90%時棄去細胞液，加入0.25%胰蛋白酶將貼壁細胞消化為單個細胞，含胎牛血清的DMEM終止消化。加入細胞生長液混勻細胞，以1∶3傳代接種于細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 體外培養(yǎng)SMMC-7721、HepG2細胞，將處于對數(shù)生長期的肝癌細胞接種至細胞培養(yǎng)板，并將其分別隨機分為mimic-133b轉(zhuǎn)染組(細胞轉(zhuǎn)染mimic-133b)和mimic-NC轉(zhuǎn)染組(細胞轉(zhuǎn)染mimic-NC)。細胞融合度70%～80%時，換全無DMEM培養(yǎng)基并進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)4～6 h，更換完全DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集細胞，進行實時定量PCR檢測；培養(yǎng)48 h后收集細胞進行免疫印跡檢測。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力 用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整肝癌細胞濃度為5×104個/ml，按每孔0.1 ml接種至96孔板，并設(shè)置調(diào)零孔(僅加入細胞生長液，不加細胞)，mimic-133b轉(zhuǎn)染組和mimic-NC轉(zhuǎn)染組分別設(shè)6個復(fù)孔，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換1次液。每孵育24 h后，取出96孔板，顯微鏡下觀察，加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h后，酶標儀檢測A450值，連續(xù)測定96 h并記錄結(jié)果。以培養(yǎng)時間為橫坐標，A450值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.6 創(chuàng)傷愈合法檢測細胞遷移能力 將肝癌細胞接種于6孔板，分為mimic-133b轉(zhuǎn)染組和mimic-NC轉(zhuǎn)染組，全無DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6 h后，更換完全DMEM培養(yǎng)基。用滅菌后200 μl槍頭在孔板中垂直劃痕，細胞培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照。

1.2.7 transwell小室法檢測細胞侵襲能力 取對數(shù)生長期的肝癌細胞，制備單細胞懸液，應(yīng)用不含血清的細胞培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，包被transwell小室上室表面，100 μl無血清培養(yǎng)基稀釋細胞懸液并接種于小室下層，加入含10%血清完全培養(yǎng)基后置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，濕棉簽拭去上層小室內(nèi)的基質(zhì)膠和細胞，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，晾干，顯微鏡下觀察，選取5個視野計數(shù)細胞數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 miR-133b在肝癌組織及細胞中表達下降 實時定量PCR檢測肝癌及正常癌旁組織中miR-133b的表達情況。結(jié)果顯示，106例肝癌患者組織中，82例肝癌組織內(nèi)miR-133b表達水平明顯低于正常癌旁組織(P<0.05)。見圖1。實時定量PCR檢測體外培養(yǎng)HB-611、BEL-7402、Hep3b、SMMC-7721和HepG2等肝癌細胞和LO2正常肝細胞中miR-133b的表達情況。結(jié)果顯示，HB-611、Hep3b、SMMC-7721和HepG2細胞中miR-133b表達水平較LO2細胞明顯降低(P<0.05)，BEL-7402細胞中miR-133b表達水平與LO2細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.2 mimic-133b可上調(diào)肝癌細胞中miR-133b的表達 實時定量PCR檢測細胞中miR-133b表達情況。結(jié)果顯示，mimic-133b轉(zhuǎn)染組細胞miR-133b表達水平顯著高于mimic-NC轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 肝癌與癌旁組織中miR-133b表達情況 圖2 多種肝癌細胞株中miR-133b表達情況

2.3 上調(diào)miR-133b表達可抑制肝癌細胞增殖 應(yīng)用CCK-8法檢測細胞增殖能力。結(jié)果顯示，mimic-133b轉(zhuǎn)染組細胞的增殖能力明顯低于mimic-NC轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖3 肝癌細胞中miR-133b表達情況(a.SMMC-7721細胞；b.HepG2細胞)

圖4 上調(diào)mimic-133b表達后肝癌細胞增殖情況(a.SMMC-7721細胞；b.HepG2細胞)

2.4 上調(diào)miR-133b表達可抑制肝癌細胞遷移 行創(chuàng)傷愈合法檢測細胞遷移能力。結(jié)果顯示，mimic-133b轉(zhuǎn)染組細胞的遷移能力明顯弱于mimic-NC轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 上調(diào)miR-133b表達后肝癌細胞的遷移能力(a.SMMC-7721細胞；b.HepG2細胞)

2.5 上調(diào)miR-133b表達可抑制肝癌細胞侵襲 采用transwell小室法檢測細胞侵襲能力。結(jié)果顯示，mimic-133b轉(zhuǎn)染組細胞的侵襲能力明顯弱于mimic-NC轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

2.6 上調(diào)miR-133b表達可下調(diào)肝癌細胞中CTGF表達 應(yīng)用免疫印跡法檢測細胞中CTGF表達情況。結(jié)果顯示，mimic-133b轉(zhuǎn)染組細胞中CTGF表達水平明顯低于mimic-NC轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

圖6 上調(diào)miR-133b表達后，肝癌細胞的侵襲能力(a.SMMC-7721細胞；b.HepG2細胞)

圖7 上調(diào)miR-133b表達后，肝癌細胞中CTGF蛋白表達情況(a.SMMC-7721細胞；b.HepG2細胞)

3 討論

miR-133b是miRNA家族成員之一，Wong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b在舌癌中表達下調(diào)。Crawford等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b可通過調(diào)控MCL-1和BCL2L2基因表達抑制肺癌細胞增殖，并具有細胞周期阻滯作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b可通過靶向調(diào)節(jié)FSCN1基因抑制腫瘤細胞的生長和侵襲[13]。由此可見，miR-133b參與多種腫瘤性疾病的發(fā)生、發(fā)展。此外，有研究表明，miR-133b下游靶基因之一為CTGF，而CTGF在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。Makino等[6]研究發(fā)現(xiàn)，CTGF可激活肝癌細胞附近的肝星狀細胞，使其向肝癌細胞傳輸促增長信號，在肝癌微環(huán)境形成中發(fā)揮重要作用。Song等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CTGF可促進Ⅰ型膠原纖維表達，并使其形成球形結(jié)構(gòu)包裹肝癌細胞，降低抗癌治療效果。miR-133b可否通過影響CTGF表達而參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，目前尚無相關(guān)報道。

本研究通過臨床收集肝癌和癌旁組織，分析其miR-133b表達差異，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-133b表達明顯低于癌旁組織。BEL-7402細胞中miR-133b表達較正常肝細胞LO2無明顯差異，這可能由于在細胞系構(gòu)建過程中存在某些影響因素。但多數(shù)肝癌細胞株，如HB-611、Hep3b、SMMC-7721及HepG2細胞中miR-133b表達均明顯低于正常肝細胞LO2。這提示，miR-133b可能參與肝癌發(fā)生、發(fā)展過程。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b在肝癌組織及細胞中表達下降，提示其可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展。進一步上調(diào)肝癌細胞系SMMC-7721及HepG2細胞內(nèi)miR-133b表達后，SMMC-7721及HepG2細胞的增殖、遷移及侵襲能力減弱。這表明，miR-133b可通過影響肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學行為調(diào)控肝癌的發(fā)生、發(fā)展。隨后上調(diào)SMMC-7721及HepG2細胞中miR-133b表達觀察CTGF表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-133b表達上調(diào)后，SMMC-7721及HepG2細胞中CTGF表達下降。這提示，miR-133b可能通過調(diào)控CTGF表達影響肝癌細胞生物學行為。

綜上所述，miR-133b可能通過下調(diào)CTGF表達來抑制肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲等，進而抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展。miR-133b有望成為臨床上治療肝癌的分子靶點之一。