王 洋， 張 建， 辛芳冉 ， 蘭 懷， 王輝山

1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管外科，遼寧 沈陽 110016

心房顫動的發(fā)病率和病死率均較高，且與腦卒中和其他栓塞性疾病相關[1-3]。小檗堿是一種異喹啉生物堿，是中藥黃連的主要活性成分。有研究表明，小檗堿具有抗心律失常、抗血小板聚集、保護心肌細胞、抗充血性心力衰竭及減輕缺血再灌注損傷等多種藥理作用[4]。

網(wǎng)絡藥理學(network pharmacology，NP)是一門應用生物學和多向藥理學理論來分析生物系統(tǒng)網(wǎng)絡并選取特定信號節(jié)點，進行多靶點藥物分子設計的新學科[5-6]。NP可通過推斷小分子與基因、蛋白質(zhì)、代謝物等靶點和網(wǎng)絡的相關性，進而構建“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡，全面系統(tǒng)地探索藥物治療疾病的作用機制。由于中藥具有多成分、多靶點、系統(tǒng)調(diào)節(jié)的特點，其被廣泛認為是一種從綜合角度識別中藥成分和藥理機制的補充方法[7]。本研究基于NP手段，構建小檗堿與心房顫動相互作用的藥物與生物分子復雜關系網(wǎng)絡，發(fā)掘藥物作用靶點及藥物與內(nèi)源性蛋白及生物通路的作用關系，科學推斷小檗堿的作用靶點，探究其治療心房顫動的分子作用機制，為基礎研究和臨床應用提供新思路和科學依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 小檗堿靶點篩選 小檗堿的化學結(jié)構通過有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫Pubchem(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫檢索關鍵詞“berberine”獲取，將其保存為Smiles格式。將得到的小檗堿Smiles結(jié)構導入Swiss Target Prediction(http://www.swisstarget-prediction.ch/)數(shù)據(jù)庫，并限定研究物種為人類(Homo sapiens)，由此獲得與小檗堿較相關的靶點信息。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索關鍵詞“berberine”，獲取小檗堿相關靶點。最后將3個數(shù)據(jù)庫所獲得的靶點合并刪除重復項，篩選出小檗堿的潛在作用靶點。

1.2 心房顫動靶點篩選 利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫[8](http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)、OMIM 數(shù)據(jù)庫[9](http://www.omim.org/)和 TTD數(shù)據(jù)庫[10](http://db.idrblab.net/ttd/)搜索疾病關鍵詞為心房顫動，合并3個數(shù)據(jù)庫結(jié)果，去除重復和假陽性結(jié)果，獲得心房顫動相關的疾病靶點。

1.3 小檗堿-心房顫動靶點互作網(wǎng)絡構建 為明確小檗堿潛在作用靶點與心房顫動相關疾病靶點之間的相互作用關系，將篩選出的小檗堿靶點與心房顫動靶點進行交集，并應用Venny軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖，篩選出小檗堿-心房顫動共同作用靶點。將篩選得到的共同作用靶點在String數(shù)據(jù)庫平臺(https://string-db.org/)構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡模型，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，“highest confidence”參數(shù)設為>0.9，其他參數(shù)不變，獲得PPI網(wǎng)絡。String數(shù)據(jù)庫是一個搜尋蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫，既包括蛋白質(zhì)之間直接物理相互作用，亦包括蛋白質(zhì)之間的間接功能相關性。

1.4 小檗堿-心房顫動靶點的生物功能注釋及KEGG通路分析 為進一步了解上述篩選出共同靶點基因的生物功能以及其在KEGG信號通路中的作用。利用Cytoscape軟件的Clue GO插件對共同作用靶點進行GO-生物學過程(biological process，BP)的生物功能富集，分析小檗堿治療心房顫動作用靶點的BP，并將共同作用靶點基因輸入DAVID平臺(https://david.ncifcrf.gov/)，選擇通路分析中KEGG信號通路，顯著性設定為P<0.05，進一步尋找小檗堿治療心房顫動的KEGG信號通路，并利用Cytoscape軟件繪制小檗堿-心房顫動共有靶點-GO-BP生物功能-KEGG信號通路網(wǎng)絡。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿、心房顫動共同作用靶點 通過在Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索小檗堿，得到其結(jié)構式，并保存Smiles格式。見圖1。通過將小檗堿的Smiles格式上傳到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，由此獲得與小檗堿較相關的靶點信息。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫、TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索關鍵詞“berberine”獲取小檗堿相關靶點。合并3個數(shù)據(jù)庫結(jié)果、刪除重復項，共篩選出小檗堿的作用靶點339個。通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫與TTD數(shù)據(jù)庫對心房顫動疾病靶點進行搜索、篩選，共獲得心房顫動相關疾病靶點398個。將339個小檗堿靶點與398個心房顫動靶點輸入Venny 2.1軟件繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得小檗堿-心房顫動共同作用靶點50個。見圖2。

圖1 小檗堿結(jié)構式 圖2 小檗堿-心房顫動共同作用靶點韋恩圖

2.2 小檗堿-心房顫動PPI網(wǎng)絡構建 將上述50個小檗堿-心房顫動共有作用靶點導入String數(shù)據(jù)庫，得到PPI相互作用關系。其中，有50個節(jié)點，396條邊。每個節(jié)點代表一個蛋白質(zhì)，每條邊代表兩個蛋白質(zhì)之間的關系，線條越多則表示其關聯(lián)度越大，即度值越大。見圖3～4。通過分析發(fā)現(xiàn)，小檗堿-心房顫動共有靶點中，白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase 3，NOS3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)等較重要。

圖3 小檗堿—心房顫動共有靶點PPI網(wǎng)絡 圖4 小檗堿-房顫共有靶點的度值

2.3 GO功能富集分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫中，對篩選出的50個小檗堿-心房顫動共同作用靶點進行GO功能富集分析得到GO條目1 644個(P<0.05)，其中，BP條目1 544個，細胞組成(cellular component，CC)條目31個，分子功能(molecular function，MF)條目69個。多個生物學功能與心房顫動的發(fā)生、發(fā)展關系密切。其中，與心房顫動有關的生物功能主要富集于脂多糖的響應、活性氧代謝過程、第二信使介導的信號傳遞、蛋白激酶活性的激活、細胞對氧化應激的反應、細胞外基質(zhì)的組織、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶級聯(lián)、急性炎癥反應、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的響應、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)活性的激活、Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)級聯(lián)等。見圖5～7。

2.4 KEGG信號通路分析 將50個小檗堿-心房顫動共有靶點輸入DAVID平臺進行KEGG通路富集分析，篩選得到128條信號通路(P<0.05)。其中，與心房顫動直接相關的有30個。小檗堿作用靶點可能與腫瘤壞死因子信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、G磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B， PI3K/Akt)信號通路、MAPK信號通路、白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)信號通路、缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號通路、VEGF信號通路、肥厚型心肌病信號通路、TGF-β信號通路等密切相關。見圖8。綜合分析GO和KEGG通路富集分析結(jié)果，篩選出可能具有治療心房顫動作用的通路，并將其與小檗堿和心房顫動共同的潛在靶點一一對應，利用Cytoscape軟件構建出小檗堿治療心房顫動的“靶點—GO-BP—KEGG”網(wǎng)絡。見圖9。

3 討論

目前，西醫(yī)治療心房顫動多采用控制心室率、恢復并維持竇性心律以及抗凝藥物或采用射頻消融、外科手術和起搏治療等非藥物療法[11]。傳統(tǒng)藥物療法有明顯的不良反應，非藥物療法其費用相對較高。因此，上述治療方法在安全性、有效性方面均受制約。隨著中藥學理論的不斷完善和發(fā)展，小檗堿作為中藥黃連的主要成分，具有治療心血管疾病特別是抗心律失常的作用，越來越廣泛用于臨床和基礎研究[12]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理的方法，發(fā)現(xiàn)小檗堿與心房顫動共有50個靶點，這些靶點是二者作用的關鍵分子基礎，并在關系網(wǎng)絡中體現(xiàn)了較好的連通特性。通過對共同作用靶點的PPI網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，IL-6、TNF、VEGF、NOS3、MMP9、STAT3等靶點在網(wǎng)絡中具有重要作用。在GO富集分析中,靶點與脂多糖的響應、活性氧代謝過程、第二信使介導的信號傳遞、蛋白激酶活性的激活、細胞對氧化應激的反應、細胞外基質(zhì)的組織、ERK1和ERK2級聯(lián)、急性炎癥反應、轉(zhuǎn)化生長因子β的響應、MAPK活性的激活、JAK-STAT級聯(lián)等密切相關。此分析過程中，多個靶點具有相似的BP，并存在多靶點協(xié)同作用的特性。這提示，小檗堿治療心房顫動可能通過上述BP發(fā)揮作用。在KEGG信號通路分析中，發(fā)現(xiàn)小檗堿可能主要通過TNF信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、PI3K-Akt、MAPK、IL-17、TLR、HIF-1、VEGF、TGF-β等信號通路作用治療心房顫動。通過對上述靶點和通路分析發(fā)現(xiàn)，小檗堿治療心房顫動的靶點與多種BP及信號通路密切相關。其作用機制主要涉及炎癥反應、氧化應激、心房纖維化及血管生成等。有研究表明，炎癥標志物IL-6和TNF在心房顫動的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[13]。IL-6大量形成可激活機體的炎癥反應與氧化應激，導致心肌增生和纖維化的形成，且可通過激活JAK/STAT信號通路實現(xiàn)其生物學功能[14]。TNF是一種重要的內(nèi)生性炎癥調(diào)節(jié)因子,在炎癥反應和免疫反應中發(fā)揮重要作用。TNF亦可通過影響心肌細胞離子通道和縫隙連接等生物學功能，使心房發(fā)生電重構，引發(fā)心房顫動[15]。心房顫動患者的IL-6和TNF表達增高，說明可以通過抑制炎癥以預防其發(fā)病[16-17]?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是誘發(fā)氧化應激的直接引物[18]。ROS水平增加可促進成纖維細胞過度增殖、遷移，激活STAT3和SMAD3信號轉(zhuǎn)導，促進心房肌纖維化，導致心房結(jié)構重構，而心房結(jié)構重構被認為是心房顫動持續(xù)的主要機制[19]。Goette等[20]研究發(fā)現(xiàn)，慢性心房顫動患者心房肌纖維化明顯，與竇性心律者比較，MAPK信號通路的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)和蛋白質(zhì)表達增加，因此，認為MAPK通路可導致心房肌結(jié)構重構，發(fā)生心房顫動。包括HIF-1信號通路和TNF信號通路在內(nèi)的氧化應激和炎癥反應的增強，在心房顫動發(fā)作中起重要作用，切斷該作用可望成為阻止心房顫動發(fā)生的新方法[21]。有研究表明，小檗堿具有抗氧化、抗炎、抗增殖和清除自由基活性的作用[22]。小檗堿可抑制脂多糖誘導的NOS3、IL-6、ROS等炎癥及氧化基因的表達[23]。McCubrey等[24]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以抑制ROS的生成，防止氧化應激的發(fā)生。小檗堿可激活PI3K/AKT通路，在有侵襲性因子存在時，可限制促炎過程和凋亡事件[25]。陳博等[26]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可通過下調(diào)TLR4的mRNA和蛋白表達，進而抑制氧化應激和炎癥反應。劉巖等[27]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可抑制JAK/STAT信號通路中STAT3磷酸化的表達。

圖5 GO功能富集分析BP 圖6 GO功能富集分析CC

圖7 GO功能富集分析MF 圖8 KEGG功能富集分析結(jié)果

圖9 小檗堿-心房顫動共有靶點-GO-BP-KEGG信號通路網(wǎng)絡圖

綜上所述，本研究整體性預測了小檗堿的功效物質(zhì)基礎和對心房顫動的分子機制，并挖掘了較多潛在的治療靶點，說明小檗堿治療心房顫動具有多靶點-多通路的作用特點。