李 軍 梁永平 鄒勝章 周長松 樊連杰,3 # 繆雄誼 謝 浩

(1.中國地質科學院巖溶地質研究所，自然資源部/廣西巖溶動力學重點實驗室，廣西 桂林 541004；2.河北建筑工程學院，河北省水質工程與水資源綜合利用重點實驗室，河北 張家口 075000；3.桂林理工大學環(huán)境科學與工程學院，廣西 桂林 541006)

微生物修復是指利用天然存在的或可培養(yǎng)的功能微生物菌群[1]，在適宜環(huán)境條件下通過自身代謝作用，將污染物降解成無毒或低毒物質的一種修復技術。目前，地下水的微生物修復研究主要包括自然衰減修復和生物刺激修復。自然衰減修復是指地下水中天然存在的微生物通過代謝作用在合理時間段內實現(xiàn)污染物濃度和總量的減少[2]，當自然衰減不足以應對污染場地修復要求時，就需人為添加修復劑或功能菌群進行環(huán)境調控，即生物刺激修復。生物刺激修復通過向污染地下水中添加修復劑，為功能菌群提供足夠的營養(yǎng)物質、能量和電子等以達到污染物快速降解的目的[3-6]。

本研究重點介紹微生物在地下水污染自然衰減修復和生物刺激修復中的關鍵問題和研究進展，特別是針對地下水不同類型污染物特點的修復研究，以期為地下水污染修復的基礎研究和實際應用提供新思路。

1 自然衰減修復

自然衰減修復的目的是在綠色修復理念基礎上將地下水中污染物的數(shù)量、可移動性、毒性降低到可接受風險水平，該修復過程相對其他修復工程，除必要的污染地下水體控制、微生物和污染物監(jiān)測與評價以外，無需實施人為工程。目前，監(jiān)測自然衰減(MNA)是國際上應用比較廣泛的一種自然衰減修復技術研究方法，但由于早期分子生物學技術的限制，多數(shù)研究停留在對污染物質量和環(huán)境地球化學信息方面的檢測上?，F(xiàn)代分子生物學和生物信息學快速發(fā)展，為揭示MNA的高級證據(jù)微生物提供支撐。利用現(xiàn)代分子生物學技術檢測微生物菌群，揭示地下水中污染物自然衰減過程和功能菌群特征，以明確自然衰減機理，評估自然衰減能力。通常監(jiān)測自然衰減方法包括污染地下水的原位微生物檢測和室內自然衰減模擬與定量檢測[14]1190。

1.1 原位微生物檢測

地下水污染物無害化自然降解過程中，必須要有能夠降解目標污染物的微生物菌群[15]，因此原位微生物檢測是證明自然衰減能力的重要方法。多數(shù)情況下，原位微生物檢測并不是在污染場地直接進行微生物定量檢測分析，通常需采集樣品及時送往實驗室進行檢測分析，該過程很大程度上依賴現(xiàn)代分子生物學技術和生物信息學分析水平。微生物多樣性與組成方面，通過對16S rRNA擴增子測序，揭示降解污染物的功能菌群的存在及其豐度，可直接說明微生物具有降解污染物的潛力[16]137。同時，污染區(qū)微生物菌群多樣性差異也能反映出污染物對微生物群落結構產生的影響[17]，已有研究表明，污染物的存在會強化部分菌群[18]，導致污染區(qū)微生物群落多樣性通常較非污染區(qū)偏低[19]；功能基因方面，利用宏基因組測序不僅可揭示與污染物轉化相關功能基因信息[20]，而且可預測菌群相關代謝潛力[21]。此外，功能基因芯片也可直接揭示污染地下水中功能基因組成與結構以及代謝潛力[22]，但該技術并不能發(fā)現(xiàn)未知的功能基因；關鍵菌群和功能基因的存在只能說明微生物具有降解污染物的潛力，并不能說明基因表達情況，從環(huán)境微生物mRNA入手進行宏轉錄組研究，可揭示污染地下水體中功能基因的表達情況和表達差異，從轉錄水平為自然衰減提供微生物代謝活動和驅動生物地球化學循環(huán)的證據(jù)。

此外，由于地下水樣品運輸、保存等過程并不能實現(xiàn)真正意義上的現(xiàn)場檢測，CHANDLER等[23]將DNA擴增、標記、雜交步驟整合為一體，設計出一款單步的微流體裝置，即放大的便攜式生物芯片，可用于污染地下水的微生物原位檢測，但該技術相對室內檢測通量較低，也不能檢測出未知的微生物信息。

1.2 室內自然衰減模擬與定量檢測

室內模擬相對天然地下水系統(tǒng)，水文地質條件更易控制，地下水污染狀態(tài)更易調節(jié)，污染物自然衰減、微生物菌群變化更易監(jiān)測和定量分析，這有利于地下水污染物自然衰減的跟蹤研究和定量化評估。目前，室內模擬地下水污染自然衰減常用的裝置包括砂箱和砂柱2種，砂箱模擬一般多用于污染物持續(xù)性的自然衰減監(jiān)測，實驗周期通常較長[24]；而砂柱模擬常用于揭示單一變量對自然衰減的影響，在控制變量條件下，往往需要利用多組砂柱來設置變量的梯度差異[25]。室內自然衰減模擬裝置中降解污染物的功能菌群可來源于原始污染的地下水，即土著微生物，也可采集其他菌群物質或投放專門經培養(yǎng)馴化的外源功能菌群。

檢測進出水污染物濃度變化是判斷模擬裝置自然衰減能力和衰減持續(xù)時間最直接的手段，而揭示污染物自然衰減機制需要從微生物菌群的角度出發(fā)。除原位微生物檢測常用的分子生物學技術外，對微生物特定物質(如核酸序列、多肽、蛋白質等)進行標記，能較好地跟蹤污染物自身降解過程和與污染物降解過程的相關微生物活動；應用熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)技術可識別與污染物轉化相關的功能基因的存在與數(shù)量，該技術受引物數(shù)量限制，并不能一次檢測多個基因，但定量檢測特定的基因較為實用；此外，今后有可能通過基因工程技術構建降解能力和適應能力更強的工程菌，可進一步在地下水污染模型中進行菌群降解能力的評價[26]，有利于更好地發(fā)揮微生物在修復地下水污染中的作用。

2 生物刺激修復

生物刺激修復通常從兩方面入手，一方面向污染地下水中添加修復劑，通過環(huán)境調控來提高土著微生物降解污染物的能力；另一方面向污染地下水中添加經實驗室馴化的功能菌群來降解污染物。相對土壤而言，向地下水中添加功能菌群的應用明顯較少。地下水環(huán)境具有無光、低溫、低氧等特點，是一個近似極端的環(huán)境[27]3，外源菌群在污染地下水中的存活難度、降解污染物的效率和時效性等不易保證。而土著微生物在污染地下水中本身已具有較強的適應能力，相對而言，溫度、pH等多數(shù)環(huán)境因子并不需要過多人工調控，因此，多數(shù)研究集中在盡可能不改變地下水環(huán)境下如何刺激土著微生物降解污染物方面。

2.1 添加劑選取

添加劑一般為微生物代謝必需的營養(yǎng)、能量和代謝過程所需的電子受供體等物質，通過強化微生物代謝能力和菌群豐度，以加速污染物的降解、轉化作用。添加劑選取需符合一定要求：不應對生命體和環(huán)境產生毒害作用；對地下水環(huán)境的改變盡可能?。荒軌驗槲⑸锕δ芫禾峁┹^多營養(yǎng)、能量和電子等。目前常用的添加劑信息詳見表1。多數(shù)添加劑相對環(huán)保，為對生命體無毒害作用的有機物，同時在地下水中具有良好的遷移性。但針對高錳酸鈉這類具有強氧化性的添加劑，其本身具有一定的殺菌作用，使用時應結合地下水污染的具體情況綜合考慮。

表1 生物刺激修復中常用的添加劑

2.2 溶解氧(DO)調節(jié)

地下水DO與氣壓、水溫、水質關系密切，同時還受水體中微生物數(shù)量、有機物濃度等綜合影響，通常地下水DO不超過純水(9 mg/L)。微生物可分為好氧微生物、兼性厭氧微生物和厭氧微生物，其代謝過程和代謝速率存在較大差異。適量、充足的氧氣是原位好氧微生物修復污染水體的關鍵所在，通?？赏ㄟ^人工曝氣和添加釋氧劑增加地下水含氧量。人工曝氣方法在地下水污染修復中應用較早，但其施工量較大。部分研究嘗試用H2O2作為地下水釋氧劑，而H2O2釋放氧氣過程僅能持續(xù)幾分鐘到幾小時，同時，其強氧化性容易導致土著微生物失活而降低污染修復效果。目前使用較多的是固相氧氣緩慢釋放劑(ORC)，常用的ORC有CaO2、MgO2和Na2CO3，其中，CaO2在地下水中生物刺激修復中應用較多，因為CaO2釋放氧氣時間較長，持續(xù)釋放時間一般介于6個月至1年以上[38]，可為地下水好氧微生物降解作用持續(xù)供氧。CaO2投放到地下水中發(fā)生如下反應[39]：

CaO2+2H2O → H2O2+Ca(OH)2

(1)

2H2O2→2H2O+O2

(2)

H2O2+e-→ OH+OH-

(3)

地下水常用增氧方法見表2。

表2 地下水常用增氧方法

3 微生物在地下水污染修復中的應用

地下水中常見污染物通常可劃分為無機氮、有機物和金屬元素3大類，微生物對不同類型污染物的修復過程不同，其修復方法的選擇存在一定差異。

地下水無機氮污染范圍通常較大而不適合實施工程，當前研究多處在自然衰減模擬階段，但針對污染嚴重的點源可酌情利用微生物進行刺激修復。多數(shù)有機物本身可作為微生物的營養(yǎng)物質而被降解，最早利用微生物進行地下水污染物自然衰減的便是有機物，而當?shù)孜锊蛔銜r，則需人工調節(jié)以促進有機物的快速降解。針對地下水中金屬元素，其不可被微生物利用性和自然衰減速率遠小于遷移速率，基本無法單獨實現(xiàn)自然衰減修復，利用微生物進行刺激修復成為降低水體金屬濃度研究的重點。

3.1 無機氮污染的微生物修復

3.2 有機物污染的微生物修復

部分有機物本身即是微生物必需的營養(yǎng)物質，這為地下水有機污染的微生物修復提供可能。早在20世紀50年代，美國科學家ZOBELL[48]發(fā)現(xiàn)微生物對環(huán)烴、苯系物、脂肪烴、芳香烴等有機物具有一定降解作用。此后，歐美國家開始利用多種手段監(jiān)測微生物降解地下水中有機物。ANNESER等[16]140研究顯示，高度專一的降解菌不僅可自然降解地下水中的BTEX(苯系物)，同時能調控低濃度有機污染暈的邊界范圍。從定性識別到定量評估，是地下水有機物污染自然衰減修復研究的重要歷程。CHOI等[49]針對韓國某軍械廠地下水BTEX和苯污染，利用電子受體貢獻率判別出不同的微生物作用降解污染物貢獻率，并實現(xiàn)定量計算BTEX和苯自然衰減速率及修復所需時間。而當微生物自然降解有機物所需時長不能達到修復要求時，便需要采取相應的修復措施刺激土著微生物。微生物降解污染物受限往往是因為底物不足導致，LIEN等[50]研究發(fā)現(xiàn)燃油泄漏位置的地下水中石油發(fā)生微生物自然衰減同時，TCE的生物修復作用也被強化，原因是石油可作為微生物主要底物增強其代謝能力，從而加速了TCE的脫氯作用。因此，該場地可通過添加石油替代性底物以獲得地下水TCE持續(xù)脫氯效果。此外，隨著國內外對地下水微污染研究的關注，越來越多的學者致力于綠色生態(tài)的修復方法來去除微污染，而自然衰減修復成為首要考慮的環(huán)保方法。ALDAS VARGAS等[27]2針對農藥引起的地下水微污染，調查并提供了與地球化學參數(shù)相關的微生物菌群組成和分布信息，這些信息有助于認識微生物對微污染自然衰減的過程和能力。

3.3 金屬污染的微生物修復

金屬元素并不像有機物一樣可被微生物直接利用，微生物通常通過氧化還原、甲基化去甲基化、生物礦化、分泌物絡合等方式降低地下水中有毒金屬毒性或固定有毒金屬[7]5。由于地下水中金屬元素濃度相對低的多，地下水中微生物對金屬污染的自然衰減能力往往較弱，而不適合利用微生物實施自然衰減修復。如何提高微生物活性來降低地下水中金屬元素的毒性成為當前研究的重點。針對地下水較多出現(xiàn)的Cr(Ⅵ)污染，采用的原位生物修復技術通常包括生物還原法、生物吸附法和生物累計法，耐Cr微生物的大量發(fā)現(xiàn)使得生物還原法成為當前研究的重點。陳國才[51]利用專門馴化的實驗菌群進行地下水Cr污染去除模擬，通過零價鐵和微生物協(xié)同作用達到去除目的，一方面零價鐵的強還原性能有效將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)，同時零價鐵厭氧環(huán)境與H2O反應產生的H2可刺激嗜氫微生物，進一步還原Cr(Ⅵ)。FAYBISHENKO等[31]在美國華盛頓漢福德基地進行了為期約3.5年的Cr污染地下水生物刺激修復工程，通過添加釋氫化合物(HRC)提高生物通量來影響電子受供體，最終顯著降低了地下水中溶解態(tài)的Cr(Ⅵ)。此后，ZHANG等[52]針對該污染場地，鑒定了在HRC刺激下與Cr(Ⅵ)還原相關的功能微生物和基因，這為設計Cr(Ⅵ)污染地下水的持續(xù)性生物刺激修復方案提供依據(jù)。

4 展 望

微生物修復是一種基于微生物自身代謝功能降解污染物的技術，通過利用和刺激土著微生物菌群，實現(xiàn)其對地下水中多種污染物的降解作用，達到地下水污染修復目的。針對地下水中無機氮、有機物和金屬元素3大類污染修復，往往需要考慮污染物種類、污染地下水體分布情況、污染程度、修復要求等因素，綜合判定微生物修復是否適用。同時，應用現(xiàn)代分子生物學技術，從微生物群落多樣性、組成、功能基因、轉錄表達等方面揭示功能微生物菌群降解污染物過程，為制定地下水污染長期的微生物修復方案提供依據(jù)。

微生物在地下水污染修復應用研究中仍存在一些急需解決的關鍵問題：(1)充足的底物供應是微生物降解的必要條件，如何保證在地下水弱電導環(huán)境中功能菌群具有足夠的底物和電子供體；(2)如何盡可能保證修復后地下水中不產生新的污染物，特別是添加劑、微生物通量和降解過程產生的二次產物；(3)目前我國多數(shù)研究處于室內模擬，如何將微生物修復技術從實驗階段大量轉化為實地修復，仍會面臨諸多問題；(4)由于地下水環(huán)境的復雜性，分子生物學技術在地下水污染修復中應用并不多，這對揭示微生物群落結構與功能對污染響應關系和污染物降解機理不利，未來應加強對此領域的深入研究。