左金龍 孫宇琪， 郭雅杰 孫艷梅 高浩澤 程首濤 王旭明#

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097)

目前，全球每年約70萬人的死亡可歸因于致病菌的抗生素抗性，世界衛(wèi)生組織已將抗生素抗性作為21世紀(jì)威脅人類健康最重要的挑戰(zhàn)之一。研究表明，臨床耐藥菌攜帶的很多抗生素抗性基因(ARGs)都具有環(huán)境起源[1]。因此，ARGs已被認(rèn)為是一類新型的環(huán)境污染物[2]，其在環(huán)境中的傳播和擴散受到了國際社會的廣泛關(guān)注。

土壤是地球上最大和最多樣化的微生物棲息地[3]，并被認(rèn)為是自然環(huán)境中ARGs的巨大儲存庫。人類活動如再生水灌溉、糞肥施用等，使土壤抗生素抗性大大提高[4]。蔬菜生產(chǎn)中，會施用大量畜禽糞肥來提高土壤肥力和產(chǎn)量[5-6]。大量研究表明，糞肥施用不但會向土壤輸入外源的ARGs，而且還能促進土著耐藥菌的增殖，從而造成土壤中ARGs的富集[7-8]。土壤中的ARGs能通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動遺傳原件在不同微生物之間轉(zhuǎn)移[9]，引起土壤ARGs的傳播擴散，加劇土壤的ARGs污染。最近的研究表明，土壤中的ARGs可遷移至蔬菜組織中，從而進入食物鏈，對人類健康構(gòu)成威脅[10]。

土壤抗生素抗性研究到現(xiàn)階段，已基本明確土壤ARGs整體上的種類和豐度[11]，但不同肥料連續(xù)多年施用對土壤抗生素抗性影響的差異還缺少系統(tǒng)研究，這在一定程度上阻礙了人們對農(nóng)田土壤抗生素抗性的全面認(rèn)知。本研究采用高通量熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HT-qPCR)方法(同時檢測384種ARGs及16S rRNA基因等)，對比研究北京某蔬菜基地長期采用4種施肥方式(不施肥、單施化肥、單施有機肥、常規(guī)施肥)土壤中ARGs的豐度與多樣性，分析了ARGs與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，以掌握不同肥料施用土壤中ARGs的分布特征，旨在為農(nóng)田土壤ARGs污染的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 采樣點

采樣點位于北京市大興區(qū)某蔬菜基地(39°66′N，116°57′E)，溫室面積488 m2(61 m×8 m)。該溫室從2009年春季開始，采用4種施肥處理，即(1)不施肥；(2)單施化肥：尿素、磷酸二銨、硫酸鉀分別為0.04、0.05、0.03 kg/m2；(3)單施有機肥：商品有機肥2.38 kg/m2；(4)常規(guī)施肥：復(fù)合肥(氮、磷、鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、10%和15%)、商品有機肥分別為0.06、1.20 kg/m2。商品有機肥主要原料為雞糞和食用菌菌糠，經(jīng)高溫好氧發(fā)酵制成粉末狀物質(zhì)。每個處理設(shè)置3個小區(qū)。每個處理之間設(shè)置50 cm深的隔斷，用塑料薄膜隔開，以避免不同處理間的干擾。溫室每年種植2茬蔬菜，上半年種植茄子，下半年種植甜椒。在每茬蔬菜種植前進行施肥。

1.2 樣品采集與處理

2018年6月采集土壤樣品。采用5點混合采樣法采集每個小區(qū)的表層土壤(0～20 cm)，每個處理采集3份重復(fù)樣品。土壤過2 mm篩，一部分風(fēng)干后用于理化性質(zhì)分析，其余保存于-80 ℃用于DNA的提取。

1.3 土壤理化性質(zhì)分析

土壤pH測定采用電位法；有機質(zhì)(OM)采用高溫外熱重鉻酸鉀法測定；TN測定采用堿解擴散法[12]。速效鉀(AK)采用火焰光度計(FP640)測定；有效磷(AP)采用紫外可見分光光度計(UV-1800PC)測定。

1.4 DNA提取

土壤樣品總DNA提取使用試劑盒(FastDNA SPIN Kit For Soil，美國)，按照說明書要求進行操作。DNA提取完畢后，用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop)檢測含量及純度，以便進行后續(xù)分析。

1.5 ARGs的HT-qPCR檢測

采用Wafergen智能芯片實時PCR系統(tǒng)進行ARGs的定量分析。設(shè)置384對引物[13-15]，包括348種ARGs、32個轉(zhuǎn)座酶基因、1個16S rRNA基因、3個整合酶基因(int1、intl2和intl3)。這348個ARGs的引物幾乎覆蓋了所有已知的ARGs亞型。HT-qPCR的384板每個孔樣品預(yù)混液體系包括：12.8 μL樣品預(yù)混液(SYBR Green Ⅰ Mix (2X) 8 μL，1 mg/mL牛血清蛋白0.8 μL，無菌水4 μL)與3.2 μL稀釋好的DNA(20～40 ng/μL)；384板每個孔引物預(yù)混液體系包括：9.6 μL引物預(yù)混液(SYBR Green Ⅰ Mix (2X) 6 μL，無菌水3.6 μL)與2.4 μL引物。將引物預(yù)混液與樣品預(yù)混液噴于同一芯片上，進行后續(xù)擴增分析。熱循環(huán)過程：先95 ℃ 10 min，再95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s進行40次循環(huán)。以16S rRNA基因校準(zhǔn)，歸一化計算得出目標(biāo)ARGs的相對豐度[16]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用R語言PCoA軟件包繪制主坐標(biāo)分析圖，分析不同處理中總的ARGs的組成特征。利用R語言pheatmap軟件包繪制熱圖，對比分析不同處理中ARGs的豐度差異。采用R語言TukeyHSD方法對不同處理中ARGs豐度差異進行統(tǒng)計分析。采用Mantel檢驗和冗余分析(RDA)解釋重金屬(As、Hg、Cu、Cr、Pb、Cd、Zn)、營養(yǎng)因子(OM、TN、AP、AK)、pH和ARGs之間的關(guān)系。利用R語言pheatmap軟件包構(gòu)建不同處理間的優(yōu)勢ARGs，進一步量化環(huán)境因素對ARGs變化的貢獻。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARGs組成分析

4種蔬菜土壤中共檢測到12～59種ARGs亞型(見表1)，其中常規(guī)施肥土壤中ARGs數(shù)量最多，其次為單施有機肥，分別約為不施肥土壤的5、3倍。單施有機肥和常規(guī)施肥土壤中，氨基糖苷類ARGs的數(shù)量最多，其次為多重耐藥類。

表1 蔬菜土壤中ARGs數(shù)量

由圖1可看出，有10種ARGs亞型為4種施肥處理土壤的核心ARGs(即共有ARGs)。ARGs亞型分別為aacC4、APH(6)-Ia、blaOXY-1、mefA、oleC、czcA、qacH-351、fabK、mcr-1、tetA(P)。

圖1 蔬菜土壤中共有ARGs數(shù)量的Venn圖Fig.1 Venn diagram of common ARGs number in the vegetable soil

2.2 ARGs豐度

不施肥、單施化肥、單施有機肥和常規(guī)施肥土壤中ARGs總相對豐度分別為0.848 9%、0.730 7%、1.093 8%和3.020 8%(見表2)，與文獻[17]相近。其中，常規(guī)施肥土壤中ARGs總相對豐度顯著高于其他3種土壤(P<0.05)，而單施化肥、單施有機肥和不施肥土壤之間無顯著性差異。不施肥、單施化肥和單施有機肥土壤中多重耐藥類ARGs相對豐度明顯高于其他抗性基因型。常規(guī)施肥土壤中優(yōu)勢ARGs除多重耐藥類外，磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類等ARGs也具有較高相對豐度。與不施肥土壤相比，單施化肥對ARGs總相對豐度和不同類型ARGs相對豐度的影響不大，但單施有機肥明顯增加了糖肽類、大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類ARGs豐度。WANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，施用有機肥顯著提高了ARGs的相對豐度和檢出數(shù)量，施用化肥對ARGs的相對豐度沒有明顯影響。

表2 蔬菜土壤中ARGs相對豐度

由圖2可見，與不施肥土壤相比，常規(guī)施肥明顯增加土壤中大多數(shù)ARGs亞型相對豐度；單施有機肥明顯增加土壤中oleC(大環(huán)內(nèi)脂類)、qacH-351(多重耐藥類)、sul1NEW(磺胺類)等ARGs亞型相對豐度，tet32(四環(huán)素類)、mexA(多重耐藥類)、tetB(四環(huán)素類)為單施有機肥土壤中特有的ARGs，說明施加有機肥可增加土壤中ARGs種類；單施化肥土壤中抗性基因相對豐度則沒有明顯變化。czcA(多重耐藥類)在所有處理中相對豐度均較高。

2.3 土壤理化性質(zhì)與ARGs的相關(guān)性分析

由表3可見，重金屬Cu、Zn、Cd，營養(yǎng)因子TN、OM、AP、AK與ARGs均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表3 土壤ARGs與理化性質(zhì)關(guān)系的Mantel測試結(jié)果

采用RDA進一步評估個體變量對ARGs變化的貢獻，結(jié)果見圖3。12個環(huán)境因子分散于4個象限中，大多聚類在第Ⅰ象限。第1、2排序軸特征值分別為88.22%、7.63%，可解釋ARGs差異總方差值的95.85%。單施有機肥土壤中ARGs與As、Cu、Zn、Cd、AP、OM、TN呈顯著正相關(guān)；pH與不施肥和單施化肥土壤中ARGs呈顯著正相關(guān)；Pb和Cr與常規(guī)施肥土壤中的ARGs呈顯著正相關(guān)。單施化肥土壤的ARGs與不施肥土壤聚類，分布在第Ⅲ象限中，而單施有機肥、常規(guī)施肥土壤ARGs則分別分散在第Ⅰ、Ⅳ象限，說明施加有機肥顯著改變了土壤ARGs的分布特征。這一結(jié)果進一步支持了不同處理土壤ARGs豐度差異的結(jié)論。何燕等[19]對四川省7個不同地區(qū)的稻田土壤進行了研究，也發(fā)現(xiàn)了TN與ARGs呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。其他研究表明，重金屬、營養(yǎng)因子等可促進ARGs在環(huán)境中的持久性和擴散[20-21]。因此，重金屬、營養(yǎng)因子與蔬菜土壤中ARGs有著密切的關(guān)系。

注：MF1～MF3、OF1～OF3、CK1～CK3、IF1～IF3分別為常規(guī)施肥、單施有機肥、不施肥、單施化肥的3個小區(qū)。

注：RDA 1、RDA 2分別為第1、2排序軸。圖3 土壤理化性質(zhì)與ARGs的RDAFig.3 Redundancy analysis of soil physical and chemical properties and ARGs

3 結(jié) 論

(1) 常規(guī)施肥土壤中ARGs數(shù)量最多。有10種ARGs亞型為4種施肥處理土壤的核心ARGs。

(2) 常規(guī)施肥土壤中ARGs總相對豐度顯著高于其他3種土壤(P<0.05)。czcA在所有處理中相對豐度均較高。

(3) 重金屬Cu、Zn、Cd，營養(yǎng)因子TN、OM、AP、AK與ARGs均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。