宇文婷，羅雅妮，黎滿慧，史菲，熊軼

哮喘是發(fā)生在氣道的慢性炎癥性疾病，隨著發(fā)病率和死亡率的增加，其成為了重點關(guān)注的疾?。?］。哮喘的特征包括氣道變窄、可逆性氣流阻塞、氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑［2-3］。而氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖、遷移功能的異常會進一步導(dǎo)致氣道重塑［4］。因此，研究ASMCs功能的影響因素并進行干預(yù)有助于緩解患者哮喘癥狀。哮喘的病因目前尚不完全清楚，但是已經(jīng)有研究表明，遺傳學(xué)在其中發(fā)揮著重要作用，非編碼RNA調(diào)控是主要的表觀遺傳機制之一［5］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是指由18～25個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，可以與靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated regions，3'-UTR）結(jié)合，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平［6］。研究表明，異常表達的miRNA可能參與哮喘的發(fā)生發(fā)展［7］。已有文獻報道，miRNA-107在膀胱癌和胃腸癌中呈低表達，且抑制miRNA-107的表達可以促進腫瘤細胞的增殖和遷移［8-9］。但是，miRNA-107對ASMCs功能的影響尚未見報道。本研究主要探討miRNA-107對ASMCs增殖和遷移的影響，以期為將miRNA-107應(yīng)用于哮喘的診斷和治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 20只4～6周的SPF級雌性BABL/c小鼠均購自廣東省實驗動物中心，動物實驗許可證號為SYXK（粵）2015-0106。小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，自由進食、飲水，保持12 h晝夜節(jié)律。本研究經(jīng)深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.1.2 實驗試劑及儀器 DMEM-F12培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰酶、青/鏈霉素、羊抗兔488二抗（美國Invitrogen公司）；Ⅰ型膠原酶（sigma公司）；viafect轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Promega公司）；熒光定量試劑盒、BrdU細胞增殖檢測試劑盒（比色分析法）（美國Roche公司）；兔源α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（美國Abcam公司）；穿梭小室（美國Corning公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗時間 本研究時間為2019年9月—2020年12月。

1.2.2 ASMCs的培養(yǎng) 將6～8周的小鼠脫頸處死后，在75%乙醇溶液中浸泡2～5 min；將肺和氣管完整取出，研磨肺上皮，露出透明的支氣管；將氣管和支氣管切成1 mm的小塊，加入3 ml 2 mg/L的Ⅰ型膠原酶和2 ml 0.25%的胰酶混合消化25 min，用含20% FBS和1%青/鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基終止消化后以1 000 r/min離心5 min（離心半徑17.8 cm），去除上清液，用5 ml含20% FBS和1%青/鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細胞并置于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，細胞貼壁后換液。

1.2.3 ASMCs的免疫熒光鑒定 將1×104個對數(shù)生長期的ASMCs鋪到35 mm的培養(yǎng)皿中，24 h后吸掉培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2次，每次5 min；用4%多聚甲醛室溫固定30 min；用PBS洗3次，每次5 min；加入免疫熒光封閉液，室溫封閉1 h；加入用免疫熒光一抗稀釋液稀釋的兔源α-SMA抗體，4 ℃過夜；用免疫熒光清洗液洗3次，每次5 min；加入用免疫熒光二抗稀釋液稀釋的羊抗兔488二抗，室溫孵育2 h；用PBS洗4次，每次10 min；加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），室溫孵育6 min，然后用雙蒸水洗2次，每次5 min；加適量的抗熒光淬滅劑于載玻片，取出蓋玻片倒置于載玻片上，風(fēng)干后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。其中綠色熒光（α-SMA）標(biāo)記ASMCs中的平滑肌肌動蛋白，藍色熒光（DAPI）標(biāo)記ASMCs的細胞核。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染與分組 運用viafect轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染細胞，具體操作如下：在6孔板的每孔中接種2×105個對數(shù)生長期的ASMCs，1 d后細胞融合度達到60%～70%。將細胞隨機分為miRNA-107模擬物組（miRNA-107 mimic組）、模擬物對照組（mimic NC組）和miRNA-107抑制劑組（miRNA-107 inhibitor組）、抑制劑對照組（inhibitor NC組）。miRNA-107 mimic組和mimic NC組的細胞分別轉(zhuǎn)染5 μl 20 μmol/L的 miRNA-107 mimic或 5 μl 20 μmol/L的 mimic NC+7.5 μl viafect+200 μl Opti-MEM 無 血 清 培 養(yǎng) 基；miRNA-107 inhibitor組和inhibitor NC組的細胞分別轉(zhuǎn)染 10 μl 20 μmol/L 的 miRNA-107 inhibitor或 10 μl 20 μmol/L 的 inhibitor NC+15 μl viafect+200 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基。加入2 ml含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.5 ASMCs中miRNA-107相對表達水平檢測 采用熒光定量試劑盒檢測各組ASMCs中miRNA-107相對表達水平。采用Trizol法提取轉(zhuǎn)染48 h的ASMCs的RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用無核酸酶水稀釋10倍；將2.6 μl無核酸酶水、0.2 μl 10 μmol/L的特異引物F、0.2 μl 10 μmol//L的特異引物R、5 μl 2×核苷酸膠體染料（SYBR Green）、2 μl cDNA加入96孔板。進行PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共39個循環(huán)；溶解曲線：從65 ℃緩慢增加到95 ℃。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miRNA-107相對表達水平。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.6 細胞增殖能力檢測 運用BrdU細胞增殖檢測試劑盒（比色分析法）檢測各組細胞增殖能力。在96孔板的每孔中放入5 000個對數(shù)生長期的ASMCs，轉(zhuǎn)染2 d后，每孔加入10 μl BrdU標(biāo)記液和100 μl含10% FBS和1%青/鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基，孵育4 h；吸掉標(biāo)記液，每孔加入200 μl固定液，室溫孵育30 min；去掉固定液，每孔加入100 μl BrdU抗體，室溫孵育1.5 h；去除抗體，每孔加入200～300 μl洗液，洗3次；去除洗液，每孔加入100 μl底物，室溫孵育20 min，檢測370/492 nm處的吸光度，其差值代表細胞增殖能力。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.7 細胞遷移能力檢測 運用穿梭小室檢測各組細胞遷移能力。在6孔板的每孔中接種2×105個對數(shù)生長期的ASMCs，轉(zhuǎn)染2 d后用胰酶消化，用450 μl DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細胞；每孔上室加入150 μl細胞懸液，下室加入700 μl含10% FBS和1%青/鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育1 d；用棉簽將小室內(nèi)面的細胞去除，用4%多聚甲醛固定遷移細胞，用0.5%結(jié)晶紫染色液染色，將穿梭小室倒置于普通光學(xué)顯微鏡下，計算5個隨機視野的細胞數(shù)，其均值代表細胞遷移能力。實驗獨立重復(fù)3次。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察ASMCs的鑒定結(jié)果。（2）分別比較miRNA-107 mimic組與mimic NC組、miRNA-107 inhibitor組與inhibitor NC組ASMCs中miRNA-107相對表達水平、細胞增殖能力和細胞遷移能力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASMCs的鑒定 ASMCs從組織塊周圍呈放射狀萌出，7 d后逐漸長滿培養(yǎng)瓶，呈谷峰狀，見圖1A。首次傳代后，ASMCs呈梭形，多有突起，生長致密且平行排列，見圖1B。培養(yǎng)2代后的ASMCs經(jīng)免疫熒光鑒定后有綠色熒光，見圖1C。經(jīng)鑒定，99%以上的細胞均是ASMCs。

圖1 小鼠原代ASMCs的形態(tài)及鑒定結(jié)果Figure 1 Morphology and identification results of primary ASMCs of mouse

2.2 miRNA-107 mimic組與mimic NC組ASMCs中miRNA-107相對表達水平、細胞增殖能力和細胞遷移能力比較 miRNA-107 mimic組ASMCs中miRNA-107相對表達水平高于mimic NC組，吸光度差值、遷移細胞數(shù)低于mimic NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖2A～B。

表1 miRNA-107 mimic組與mimic NC組 ASMCs中 miRNA-107相對表達水平、吸光度差值和遷移細胞數(shù)比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of miRNA-107 relative expression level in ASMCs，absorbance difference and number of migrating cells between miRNA-107 mimic group and mimic NC group

表1 miRNA-107 mimic組與mimic NC組 ASMCs中 miRNA-107相對表達水平、吸光度差值和遷移細胞數(shù)比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of miRNA-107 relative expression level in ASMCs，absorbance difference and number of migrating cells between miRNA-107 mimic group and mimic NC group

注：ASMCs=氣道平滑肌細胞，miRNA=微小RNA，mimic NC組=模擬物對照組，miRNA-107 mimic組=miRNA-107模擬物組

組別 ASMCs中miRNA-107相對表達水平吸光度差值遷移細胞數(shù)（個/視野）mimic NC 組 1.004±0.114 1.50±0.28 58.20±6.30 miRNA-107 mimic組 187.687±9.748 0.96±0.11 31.33±6.82 t值 -33.167 3.051 5.015 P值 ＜0.001 0.038 0.007

2.3 miRNA-107 inhibitor組與inhibitor NC組ASMCs中miRNA相對表達水平、細胞增殖能力和細胞遷移能力比較 miRNA-107 inhibitor組ASMCs中miRNA-107相對表達水平低于inhibitor NC組，吸光度差值、遷移細胞數(shù)高于inhibitor NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖2C～D。

圖2 各組細胞遷移能力檢測結(jié)果（結(jié)晶紫染色，×10）Figure 2 Results of cell migration ability test in each group

表2 miRNA-107 inhibitor組與inhibitor NC組ASMCs中miRNA-107相對表達水平、吸光度差值和遷移細胞數(shù)比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of miRNA-107 relative expression level in ASMCs，absorbance difference and number of migrating cells between miRNA-107 inhibitor group and inhibitor NC group

表2 miRNA-107 inhibitor組與inhibitor NC組ASMCs中miRNA-107相對表達水平、吸光度差值和遷移細胞數(shù)比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of miRNA-107 relative expression level in ASMCs，absorbance difference and number of migrating cells between miRNA-107 inhibitor group and inhibitor NC group

注：inhibitor NC組=抑制劑對照組，miRNA-107 inhibitor組=miRNA-107抑制劑組

組別A S M C s中m i R N A-1 0 7相對表達水平吸光度差值遷移細胞數(shù)（個/視野）i n h i b i t o r N C 組 1.0 0 3±0.9 9 6 0.9 3±0.2 8 3 0.5 3±1.7 5 m i R N A-1 0 7 i n h i b i t o r組 0.1 3 0±0.0 4 0 1.7 0±0.3 7 4 6.9 3±7.2 9 t值 1 4.0 6 6 -2.9 0 2 -3.7 8 7 P值 ＜0.0 0 1 0.0 4 4 0.0 1 9

3 討論

哮喘是一種以氣道平滑肌功能異常為核心的疾?。?0］。大量文獻表明，ASMCs的異常增殖和遷移是氣道重塑的重要因素［11-12］。已有研究表明，miRNA可能調(diào)節(jié)氣道平滑肌的功能，導(dǎo)致氣道重塑，從而引發(fā)哮喘癥狀［13］。為了研究miRNA-107在哮喘發(fā)展中的作用，本研究原代培養(yǎng)了小鼠的ASMCs，探究過表達或抑制miRNA-107對ASMCs增殖和遷移的影響。

本研究運用免疫熒光驗證了培養(yǎng)的細胞是ASMCs，這為后續(xù)的實驗奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，miRNA-107 mimic組ASMCs中miRNA-107相對表達水平高于mimic NC組，吸光度差值、遷移細胞數(shù)低 于 mimic NC組；miRNA-107 inhibitor組 ASMCs中miRNA-107相對表達水平低于inhibitor NC組，吸光度差值、遷移細胞數(shù)高于inhibitor NC組。提示過表達miRNA-107可以抑制ASMCs的增殖和遷移能力，而抑制miRNA-107的表達可以促進ASMCs的增殖和遷移能力，這與既往研究結(jié)果一致［14-15］。既往研究表明，miRNA-107可以通過靶向第10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsometen，PTEN）或細胞分裂蛋白激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移［16-17］。這提示miRNA-107可能通過調(diào)節(jié)下游靶基因的表達，影響與細胞增殖和遷移有關(guān)的信號通路，進而影響ASMCs的功能。

目前哮喘的治療方法主要是針對氣道阻塞和氣道炎癥，如支氣管擴張劑、皮質(zhì)類固醇、白介素受體拮抗劑和抗lgE治療等［18］，但這些方法的預(yù)后并不是很好。因此，探索新的治療哮喘的靶標(biāo)有著重要的臨床意義。本研究結(jié)果為將來運用miRNA模擬物抑制哮喘的發(fā)生發(fā)展提供了一定理論依據(jù)，但本研究未探討miRNA-107影響ASMCs功能的具體分子機制，仍需要進一步探究。

綜上所述，miRNA-107可以抑制ASMCs的增殖和遷移。抑制miRNA-107的表達可以促進ASMCs的增殖和遷移，這可能是哮喘患者發(fā)生氣道重塑的機制之一。因此，miRNA-107有望作為抑制氣道重塑的一個靶點，為哮喘的治療提供新的方法。但本研究未針對miRNA-107的下游蛋白及分子機制進行研究，還需要進一步研究以使miRNA-107的作用機制更加完善，為miRNA-107的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

作者貢獻：宇文婷進行實驗設(shè)計與實施、資料收集與整理，撰寫文章并對文章負責(zé)；羅雅妮、黎滿慧協(xié)助進行實驗實施；史菲進行論文、英文的修訂并提供基金支持；熊軼負責(zé)文章的質(zhì)量控制和審校，對文章整體負責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。