(1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省衡陽市421001；2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所國家重點實驗室，北京市102206；3.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市832003；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師石河子市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市832000)

在全球范圍內(nèi)，對人類和動物宿主的健康具有潛在影響的病原體被頻繁地檢測到[1]。大多數(shù)導(dǎo)致人類疾病的新發(fā)的病原體都是人獸共患病原菌，人獸共患病可以從野生或者家養(yǎng)動物傳染給人類，對公共衛(wèi)生和人類健康造成了重大威脅[2-4]。新疆是中國最大畜牧業(yè)生產(chǎn)基地之一，與8個國家接壤，國際性貿(mào)易頻繁[5]。近些年畜牧業(yè)不斷地發(fā)展，致病菌在人群中傳播速度加快，從而動物源人獸共患病的流行風(fēng)險也隨之明顯增加。牛作為新疆地區(qū)畜牧業(yè)的主要動物之一，與人們的生活生產(chǎn)密切相關(guān)，是人們重要的蛋白質(zhì)來源[6]。因此，了解規(guī)?；B(yǎng)殖牛的潛在病原菌攜帶狀況調(diào)查很有必要，對有效防治人獸共患病具有重要意義。在牧場的生產(chǎn)實踐中，傳統(tǒng)細(xì)菌病原的檢測耗時長，檢測量有限，難以滿足需求[7]。宏基因組是特定生物環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和[8]。宏基因組學(xué)二代測序技術(shù)直接獲取樣本中所有核酸片段的序列信息，與特定的數(shù)據(jù)庫比對結(jié)合生物信息分析，檢測出所有微生物的種類及序列數(shù)量[9]，目前已成為國際微生物學(xué)研究的熱點，成為開發(fā)新的生物活性物質(zhì)、研究群落中微生物多樣性的新途徑,而且宏基因組學(xué)技術(shù)自動化程度高，可以準(zhǔn)確靈敏地鑒定病原微生物[10]。本研究基于二代宏基因組學(xué)技術(shù)對新疆規(guī)?；B(yǎng)殖牧場牛群的鼻咽和肛拭子樣品中細(xì)菌種類進(jìn)行分析鑒定，探討牛攜帶潛在病原以及人獸共患病主要菌種狀況，較系統(tǒng)地評價潛在病原菌對宿主自身和人類健康的影響，為相關(guān)疾病的防控提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2019年8月從新疆南疆和北疆集中大牧場的牛群中采集牛鼻咽拭子303份和肛拭子306份，其中南疆喀什市采集牛鼻咽拭子和牛肛拭子各104份，北疆石河子市采集牛鼻咽拭子199份和牛肛拭子202份。采集過程中均使用一次性用具以避免樣品交叉污染，所有的樣品經(jīng)無菌容器密封好后放入車載冰箱運(yùn)回實驗室，樣品保存在-70 ℃超低溫冰箱。

1.2 宏基因組DNA的提取及BGISEQ測序

將待測樣品完全解凍后，采用QIAamp DNA micro Kit提取基因組DNA。檢測DNA純度和降解程度后，去除不合格樣品，將合格的鼻咽拭子/肛拭子DNA樣品，分別根據(jù)樣品編號順序按質(zhì)量1∶1比例每10份混合為一組，即鼻咽拭子和肛拭子各自混合為鼻咽拭子組和肛拭子組，不交叉混合。對混合后的DNA樣品進(jìn)行超聲片段化后，依據(jù)BGISEQ進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建，宏基因組測序由華大基因科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對于原始測序數(shù)據(jù)采用Trimmomatic去除低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)；使用Kraken2以及配套的Minikrakenv2數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類；基于物種豐度信息表，對不同類別樣品以及不同地區(qū)的樣本分別應(yīng)用R語言進(jìn)行基于Bray、Euclidean距離的主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)、相似性分析(analysis of similarities,Anosim)和多元方差分析(Adonis)。應(yīng)用Python進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗分析潛在人畜共患病原菌的差異性。

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)

BGISEQ測序原始數(shù)據(jù)通過質(zhì)控排除一定比例低質(zhì)量數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)。對于一條序列，每10個堿基為一個窗口計算堿基平均測序質(zhì)量，如果低于20，則在該窗口處切斷，并且只保留雙端都大于121 bp的reads。經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控所得29組肛拭子樣品和22組鼻咽拭子樣品的宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.2 微生物群落組成

根據(jù)宏基因組序列分析，共得到4個界40個門81個綱175個目398個科1 283個屬和4 218個種。在界分類水平上，所有樣品中相對豐度最大的均為細(xì)菌。其中，29組肛拭子樣品相對豐度為86.90%～98.42%；22組鼻咽拭子樣品相對豐度為74.51%～92.91%。這說明新疆牧場牛鼻咽部和大腸直腸部位的微生物群落組成主要是細(xì)菌。

2.3 不同樣品的細(xì)菌種類分析

2.3.1 不同類別牛樣品的細(xì)菌種類注釋分析 基于物種注釋結(jié)果，只保留在至少1個樣本中豐度大于0.01%的菌種，分析牛樣品在門和屬水平上相對豐度排名前10的細(xì)菌種類(圖1)。由圖1可知，在門分類水平上，肛拭子和鼻咽拭子樣品中細(xì)菌物種占主導(dǎo)地位的門為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。在屬分類水平上,肛拭子樣品中優(yōu)勢菌屬為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、異壁放線菌菌屬(Actinoalloteichus)、埃希氏菌屬(Escherichia)和芽孢桿菌屬(Bacillus)；而鼻咽拭子樣品中優(yōu)勢菌屬為異壁放線菌菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬(Acinetobacter)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)。

圖1 不同類別牛樣品中細(xì)菌種類排名前10位的物種豐度柱狀圖

2.3.2 不同類別牛樣品細(xì)菌群落的比較 通過PCoA分析不同樣品細(xì)菌菌群的β多樣性(圖2)。基于不同樣品類別，在門水平上，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)對所有樣品差異的貢獻(xiàn)率分別為87.32%和11.94%，累積貢獻(xiàn)率為99.26%(圖2A)；在屬水平上，PC1和PC2對所有樣品差異的貢獻(xiàn)率分別為66.85%和19.47%，累積貢獻(xiàn)率為86.32%(圖2B)。無論在門水平還是屬水平，兩組樣品在PCoA圖上均能獨自聚類，但有少部分重疊?；诓煌貐^(qū)分布，喀什市和石河子市的肛拭子樣品組出現(xiàn)交疊現(xiàn)象(圖2C)，而基于屬分類水平兩者發(fā)生了明顯的彼此分離現(xiàn)象，表現(xiàn)為獨立的分布(圖2D)。在不同分級(門和屬)水平上(圖2E和2F)，石河子市鼻咽拭子樣品基本處于中心點左側(cè)，而喀什市鼻咽拭子樣品組在中心點的左側(cè)和右側(cè)都有分布。

圖2 不同類別牛樣品細(xì)菌物種的PCoA分析A、C和E為門分類水平計算Euclidean距離；B、D和F為屬分類水平計算Bray距離。

在微生物分析中，進(jìn)行完P(guān)CoA分析后，采用Anosim分析和Adonis分析不同類別牛樣品的細(xì)菌種類差異，分別在門水平和屬水平兩個層級上進(jìn)行比較分析，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表1)，且組間差異大于組內(nèi)(R趨向于1；表1)。

表1 不同類別牛樣品的ANOSIM分析和Adonis分析

利用Wilcoxon秩和檢驗分析所有牛樣品的細(xì)菌差異種類，在門水平上差異有顯著性的菌門共3種，分別是放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。在屬水平上差異有顯著性的菌屬共16種(圖3)。

圖3 不同牛樣品細(xì)菌群落差異分析a為P<0.05，b為P<0.01，與鼻咽拭子組比較。

2.4 牛樣品中潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類

2.4.1 不同類別牛樣品中潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類的比較 牛樣品共檢出9種人獸共患病原菌(圖4)，分別是蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pluranimalium)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、化膿性鏈球菌(Trueperella pyogenes)和多殺巴斯德桿菌(Pasteurella multocida)。其中，豬鏈球菌、空腸彎曲桿菌和化膿性鏈球菌只在肛拭子樣品中檢出，鮑曼不動桿菌只在鼻咽拭子中檢出。不同類別牛樣品中共檢出的蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和肺炎鏈球菌差異存在顯著性(P<0.01)，而肺炎克雷伯氏菌和多殺巴斯德桿菌差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 不同類別牛樣品潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類的Wilcoxon秩和檢驗a為P<0.01，與鼻咽拭子組比較。

2.4.2 不同地區(qū)牛樣品中潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類的比較 Wilcoxon秩檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喀什市肛拭子樣品中的大腸桿菌和肺炎鏈球菌相對豐度極顯著高于石河子市(P<0.01)；喀什市肛拭子樣品中的蠟樣芽孢桿菌和豬鏈球菌相對豐度顯著高于石河子市(P<0.05)。兩個地區(qū)鼻咽拭子樣品中共檢出的蠟樣芽孢桿菌和肺炎鏈球菌差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；圖5)。

圖5 不同地區(qū)潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類的Wilcoxon秩和檢驗a為P<0.05，b為P<0.01，與石河子市組比較。

3 討 論

目前國內(nèi)外研究大多都是基于16S高通量測序?qū)εＨ榉垦滓约芭Ａ鑫?牛鼻咽微生物區(qū)系的報道[11-13]，而關(guān)于牛攜帶潛在人獸共患病原菌及細(xì)菌菌群多樣性全面鑒定分析的研究尚未有報道。不同的檢測方法和樣本對微生物結(jié)構(gòu)的分析各有不同，但利用先進(jìn)的二代高通量測序可對樣本中全部的微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)等進(jìn)行全面分析，進(jìn)而可以最大限度地挖掘微生物資源，也可以進(jìn)行傳染病病原溯源和潛在病原快速高通量調(diào)查[14]。

本研究應(yīng)用宏基因組二代測序技術(shù)，以牛鼻咽拭子和肛拭子樣品提取DNA對新疆南疆和北疆規(guī)?；B(yǎng)殖牧場牛潛在病原菌攜帶狀況進(jìn)行調(diào)查分析，通過對牛樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)牛腸道和牛呼吸道中微生物主要菌門均以厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門4種為優(yōu)勢菌門。既往國內(nèi)外研究不同品系的牛瘤胃微生物結(jié)果顯示主要菌種均是擬桿菌和厚壁菌[12,15]，而本研究牛腸道以放線菌門和變形菌門占主導(dǎo)，厚壁菌和擬桿菌次之，這一差異可能是因為牛的生活地域和環(huán)境，又或是喂養(yǎng)飼料的不同造成其腸道細(xì)菌菌門結(jié)構(gòu)的不同。本研究牛呼吸道中優(yōu)勢菌門與Zeineldin等[13]結(jié)果一致，但優(yōu)勢菌屬各不相同，這可能是因為養(yǎng)殖環(huán)境不同，導(dǎo)致上呼吸道不斷暴露于周圍環(huán)境中的多種細(xì)菌中[16]。在物種相對豐度的基礎(chǔ)上，本研究也進(jìn)行了相似性和差異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛呼吸道和腸道細(xì)菌菌群有一定的相似性，但差異存在顯著性(P<0.05)，并且組間差異大于組內(nèi)差異。本研究表明，新疆規(guī)?；B(yǎng)殖牧場牛攜帶的細(xì)菌群落相對豐富，且不同樣品組間存在差異。

另外，本研究對新疆南疆喀什市和北疆石河子市兩個地區(qū)的細(xì)菌菌系作比較分析，兩地區(qū)的牛肛拭子樣品在門水平上均表現(xiàn)出豐富細(xì)菌菌群，但隨著分級水平的降低，養(yǎng)殖場的細(xì)菌組成差別不斷增加，在屬水平上兩地區(qū)各類細(xì)菌在數(shù)量及分布上有顯著差異；兩地區(qū)鼻咽拭子樣品組在門和屬水平上均反映出養(yǎng)殖場細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。差異性分析結(jié)果表明兩個地區(qū)的牛肛拭子樣品和牛鼻咽拭子樣品均是組間差異大于組內(nèi)(P<0.05)。究其兩地區(qū)呈現(xiàn)出差異的原因，可能與宿主攜帶的微生物群落結(jié)構(gòu)與其遺傳背景、生長環(huán)境、生活飲食和免疫狀況等眾多因素有關(guān)[17]。

本次測序，除檢測到大量常規(guī)菌外，還從樣品中檢出了人獸共患病致病菌。本研究在牛樣品中鑒定發(fā)現(xiàn)有9種人獸共患病原菌，其中大部分都是食源性細(xì)菌性致病菌[18-20]，雖然目前這些菌種在動物的感染報道較少，但是在某些飼養(yǎng)條件不利因素誘發(fā)下，這些條件致病菌可能大量繁殖，導(dǎo)致宿主發(fā)病，所以其可能成為人獸共患病傳染病的潛在病原，應(yīng)引起高度重視。還有值得注意的是，不管基于樣品類型還是地區(qū)水平，蠟樣芽孢桿菌和肺炎鏈球菌均有分布。蠟樣芽孢桿菌被認(rèn)為是一種常見的食品污染物，可以引起人和動物產(chǎn)生嘔吐和腹瀉等臨床癥狀[21]。肺炎鏈球菌是一種革蘭氏陽性人獸共患病機(jī)會致病菌，其是一種新興的動物鏈球菌，與牛和禽類原發(fā)感染相關(guān)[22]。牛源細(xì)菌性人獸共患病致病菌不僅影響牛自身的安全，還可能對牧民以及通過牛源食品對大眾的健康產(chǎn)生威脅，因此對這類疫病的防控也尤為重要。

綜上，本研究對新疆地區(qū)牧場牛潛在病原菌攜帶狀況進(jìn)行調(diào)查，總結(jié)其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性和牛源人獸共患病致病菌的菌種，并分別比較分析了不同樣品和不同地區(qū)牛攜帶菌群的差異性。在后續(xù)研究中，可以比對不同的數(shù)據(jù)庫挖掘更多的數(shù)據(jù)，分析病毒的分布情況；結(jié)合牧民的流行病學(xué)資料和人獸共患病致病菌的疾病特征作綜合分析，評價傳播和感染的風(fēng)險，旨在為牛的規(guī)?；B(yǎng)殖和牛源食品的安全等提供更多的科學(xué)支持。