張慶華，郝勝菊，王興，陳雪，周秉博，劉芙蓉，鄭雷，馮暄，張釧

尿素循環(huán)（urea cycle，UC）是人體內(nèi)清除氨的主要途徑，有6種關(guān)鍵酶：鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（ornithine carbamoyltransferase，OTC）、N-乙酰谷氨酸合成酶（N-acetylglutamate synthase，NAGS）、氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ（carbamyl phosphate synthaseⅠ，CPSⅠ）、精氨酸琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthetase，ASS）、精氨酸代琥珀酸裂解酶（arginine succinate lyase，ASL）和精氨酸酶（arginase，ARG），兩種轉(zhuǎn)運(yùn)體（線粒體內(nèi)膜鳥氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)體）的參與，其中任何一個(gè)酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體的缺陷都會(huì)導(dǎo)致尿素循環(huán)障礙（urea cycle disorder，UCD）[1]。UCD總體發(fā)病率在活產(chǎn)嬰中約為1∶69 000～1∶35 000，其中約50%的UCD伴有新生兒高氨血癥，死亡率高達(dá)25%～50%，存活者會(huì)遺留不可逆性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2]。本研究對(duì)7例疑似UCD患兒等進(jìn)行基因檢測，以明確其致病基因及基因分型，對(duì)這些患者家系提供遺傳咨詢及再生育時(shí)的產(chǎn)前診斷。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年9月—2019年9月在甘肅省婦幼保健院（我院）收治的患兒，根據(jù)臨床表現(xiàn)與遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜檢測及尿氣相分析檢測等生化代謝改變高度疑似UCD患者7例，男4例、女3例，年齡4 d～3個(gè)月；經(jīng)患者監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書及經(jīng)醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，采集患兒及父母靜脈血2～3 mL（乙二胺四乙酸抗凝）進(jìn)行基因突變分析。

1.2 方法

1.2.1 基因突變位點(diǎn)檢測 應(yīng)用北京天根公司（中國）的基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.1.1 高通量測序 利用遺傳代謝病基因檢測panel（北京邁基諾公司）進(jìn)行高通量測序以明確致病突變，測序平均深度為200×。對(duì)檢測到的變異進(jìn)行過濾篩選，應(yīng)用PolyPhen2和MutationTaster軟件對(duì)新變異進(jìn)行蛋白功能預(yù)測，新變異致病性判讀根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)2015指南進(jìn)行。

1.2.1.2 突變位點(diǎn)驗(yàn)證分析 ①Sanger測序。應(yīng)用Primer5軟件針對(duì)變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物用純化試劑盒純化后，上機(jī)進(jìn)行測序（ABI3500DX，美國），應(yīng)用SeqMan軟件對(duì)測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。②長距離-PCR（LDPCR）。使用Long PCR試劑盒（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳來檢測SLC25A13基因IVS16ins3kb位點(diǎn)突變情況。③多重連接探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技術(shù)分析。對(duì)1例OTC缺乏的患兒通過MLPAP079探針（MRC-Holland）進(jìn)行檢測；1例新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥（neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency，NICCD）疑似合并脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）先證者通過P060探針（MRCHolland）進(jìn)行檢測；按照試劑盒說明書操作完成MLPA反應(yīng)。MLPA反應(yīng)產(chǎn)物在ABI3500DX測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。電泳結(jié)果采樣MLPA數(shù)據(jù)分析專用軟件Coffalyser進(jìn)行分析。

1.2.2 產(chǎn)前診斷 患兒母親再孕時(shí)，孕18～21周經(jīng)腹行羊膜腔穿刺，抽取羊水15 mL行先證者突變位點(diǎn)檢測。

2 結(jié)果

2.1 患者基因測序分析結(jié)果

2.1.1 高通量測序及Sanger測序結(jié)果 例1檢測到SLC25A13基因自發(fā)雜合突變c.1737G＞A；例2檢測到SLC25A13基因父源雜合突變c.1364G＞T，檢測到母源雜合突變c.1660_1661ins16bp；例3檢測到SLC25A13基因父源雜合突變c.1638_1660dup23；例4檢測到SLC25A13基因父源雜合突變c.1638_1660dup23；例5檢測到ASS1基因父源雜合突變c.1088G＞A，檢測到母源雜合突變c.787G＞A；例6檢測到OTC基因自發(fā)半合子突變c.958C＞T。見表1。

2.1.2 LD-PCR檢測結(jié)果 例1及其母親、例3及其母親、例4及其母親均檢測到SLC25A13基因雜合突變IVS16ins3kb。見表1。

2.1.3 MLPA檢測結(jié)果 P060探針在例1上檢測到SMN1基因E7-8del純合突變，其父母均為雜合突變攜帶者。P079探針在例7上檢測到OTC基因雜合突變Exon7-9Del，其母親為7-9外顯子的雜合性缺失突變攜帶者，例7和其母親均檢測到雜合突變，但母親未患病。見表1。

通過分子檢測，7例疑似UCD患兒得到了明確分型：4例為NICCD（57%），1例為瓜氨酸血癥Ⅰ型（CTLN1，14.3%），2例為鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥（ornithine carbamoyltransferase deficiency，OTCD，28.7%），見表1。

表1 7例UCD患者的臨床表型及基因檢測結(jié)果

本研究共發(fā)現(xiàn)3 個(gè)UCD 相關(guān)致病基因：SLC25A13、ASS1和OTC，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的9個(gè)等位基因突變，包括3種錯(cuò)義突變、2種移碼突變、1種無義突變、1種插入突變，1種缺失突變。其中突變頻率最高的是SLC25A13基因IVS16ins3kb等位基因突變，見表2。

表2 7例UCD患者家系主要基因突變類型及頻率

2.2 產(chǎn)前診斷結(jié)果分析例2和例6家系再次妊娠時(shí)，在孕19周通過羊水穿刺進(jìn)行了產(chǎn)前基因診斷：例2家系胎兒檢測到SLC25A13基因c.1364G＞T父源致病基因攜帶變異，見圖1A和圖1B；例6家系胎兒未檢測到與先證者相同的OTC基因c.958C＞T半合子突變，見圖1C）。經(jīng)遺傳咨詢后，告知這兩家系胎兒患病風(fēng)險(xiǎn)較低，這兩家系均選擇了繼續(xù)妊娠，胎兒隨訪至生后1個(gè)月，足跟血串聯(lián)質(zhì)譜檢查未見異常，發(fā)育良好。

圖1 產(chǎn)前診斷測序圖

3 討論

3.1 基因檢測可對(duì)UCD患兒進(jìn)行精確分型UCD是一組遺傳代謝病，患兒的體征、臨床表現(xiàn)未見特異性，難以進(jìn)行鑒別診斷。因此對(duì)相關(guān)致病基因進(jìn)行基因診斷尤為重要。本研究通過對(duì)7例疑似UCD患兒進(jìn)行基因診斷后，發(fā)現(xiàn)5例瓜氨酸血癥（4例NICCD及1例CTLN1） 和2例OTCD。其中病例1較罕見，除SLC25A13基因復(fù)合雜合突變外還伴有SMN1基因外顯子7和8純合缺失，該患兒共患NICCD及SMA。

3.2 UCD致病基因的異質(zhì)性瓜氨酸血癥是一組通常表現(xiàn)為神經(jīng)精神癥狀及血清中瓜氨酸和氨濃度升高的UCD，通常分為Ⅱ型（NICCD）和Ⅰ型（CTLN1），分別為SLC25A13和ASS1雙等位基因變異導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳病[3]。

瓜氨酸血癥Ⅱ型（NICCD）由SLC25A13基因突變所致。其發(fā)病率具有地域性差異，在我國南方約1/9 200，北方約1/3 500 000，我國呈南高北低趨勢。同時(shí)，NICCD致病基因的攜帶率及突變類型亦有差異：SLC25A13基因雜合子攜帶率在日本、韓國人群中分別為1/69、1/50[4]，中國人群中為1/63；已報(bào)道的SLC25A13基因致病突變類型超過90種，而中國人群中c.851_854delGTAT、c.1638-1660dup23、c.615+5G＞A、IVS16ins3kb 和c.1399C＞T 等5 個(gè)突變約占85.40%的突變等位基因，構(gòu)成中國人普遍存在的SLC25A13突變[5]。本研究共檢測出4例NICCD患兒，發(fā)現(xiàn)5 種SLC25A13 等位基因變異（IVS16ins3kb、c.1638-1660dup23、c.1364G＞T、c.1737G＞A和c.1660_1661ins23），其中IVS16ins3kb和c.1638-1660dup23與研究報(bào)道其在中國人群高發(fā)[4]相符。此外，上述變異存在地域差異，如：IVS16ins3kb作為一種轉(zhuǎn)座后插入突變，在日本較為常見[6]，在中國北方人群高于南方；c.1364G＞T在中國北方較為常見；而c.1638-1660dup23的相對(duì)頻率在中國不同區(qū)域則相對(duì)一致[7]。本研究4例NICCD患兒中，有3例均有SLC25A13基因IVS16ins3kb雜合突變（3/4），與在中國北方較為常見的趨勢一致。

瓜氨酸血癥Ⅰ型（CTLN1）是由于ASS基因突變所致，是UCD中第三大類型，發(fā)病率約為1/200 000～1/44 300[3]。其致病基因ASS1基因突變頻率具有一定的地域性分布差異，且不同基因與臨床表型嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究共發(fā)現(xiàn)2個(gè)ASS1等位基因錯(cuò)義突變，分別為c.787G＞A（p.Val263Met）和c.1088G＞A（p.Arg363Trp)。有研究報(bào)道ASS1基因攜帶亦存在地域性差異：p.Arg363Trp在德國（包括德國人和居住在德國的土耳其人）患者中的攜帶率為13.5%；而p.Val263Met在土耳其患者中攜帶率為7.9%[8]。本研究中因ASS1等位基因變異較少，突變頻率是否存在地區(qū)性差異有待后續(xù)進(jìn)一步分析。同時(shí)，有研究報(bào)道p.Val263Met等位基因復(fù)合雜合或純合突變情況下多表現(xiàn)為遲發(fā)和（或）輕度瓜氨酸血癥[9]。本研究中患者目前僅主要表現(xiàn)為血清瓜氨酸指標(biāo)等異常增高；未見其他顯著臨床表現(xiàn)，臨床表型與這一等位基因復(fù)合雜合變異表型相符，故而，對(duì)于這種輕型或遲發(fā)型CTLN1，基因診斷顯得更加重要，及時(shí)應(yīng)用基因診斷明確變異類型，高度重視予以積極治療及預(yù)防，可有效避免突發(fā)異常的出現(xiàn)。

OTCD由OTC基因突變引起，是UCD中最常見的亞型，平均發(fā)病率為7.1/100 000，屬于X連鎖不完全顯性或X連鎖隱性遺傳代謝??；OTCD的臨床表現(xiàn)主要與酶的殘余活性相關(guān)。目前OTC基因已報(bào)道超過400種基因突變類型[10]。本研究共發(fā)現(xiàn)2個(gè)OTC等位基因分別為c.958C＞T和外顯子7-10缺失；其中無義突變c.958C＞T（p.R320X）為一男性半合子突變患兒，該男性患者病情較重，主要是由于OTC基因攜帶在X染色體上，這一酶的活性在男孩體內(nèi)完全失活，導(dǎo)致急性氨中毒，該臨床表型與XL基因變異遺傳模式相符；而另一等位基因變異外顯子7-10缺失，為一女性雜合子突變患兒。通常女性雜合子突變，臨床表現(xiàn)高度多樣，約15%患者發(fā)病；多數(shù)雜合子攜帶者不出現(xiàn)高氨血癥[11]。由于實(shí)驗(yàn)條件限制，本研究沒有做X染色體隨機(jī)失活檢測，但筆者推測例7正常的那條X染色體發(fā)生了非隨機(jī)失活，從而導(dǎo)致了疾病的發(fā)生[12-13]。

3.3產(chǎn)前基因診斷可避免患兒出生本研究為2個(gè)再生育家系提供產(chǎn)前基因診斷：例2家系胎兒檢測到SLC25A13基因c.1364G＞T父源攜帶突變；例6家系胎兒未檢測到與先證者相同的OTC基因c.958C＞T半合子突變。2個(gè)家庭均選擇了繼續(xù)妊娠，出生后隨訪至1個(gè)月，生化指標(biāo)及發(fā)育狀況均正常。

綜上，筆者對(duì)7例疑似UCD患兒進(jìn)行了基因分析，明確了其治病原因，并對(duì)兩患者家系再生育時(shí)進(jìn)行了產(chǎn)前診斷。通過高通量測序技術(shù)對(duì)患者進(jìn)行基因分型后可及早給予干預(yù)治療，可為遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供可靠依據(jù)[14-16]；進(jìn)而在致病基因明確的前提下，通過產(chǎn)前診斷或胚胎植入前單基因病檢測（PGT-M）有效預(yù)防出生缺陷。