李曉，郭艷麗，韓俊婷，鄒曉萍，董渠龍

大氣顆粒物中空氣動力學直徑≤2.5 μm的細顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）是環(huán)境污染物之一，其特點為粒徑小、面積大、活性強和成分復雜，不僅能吸附多種有機碳、硝酸鹽、硫酸鹽和重金屬等有毒有害物質，且能在大氣中長時間停留、輸送距離遠，因此對人體健康存在巨大的威脅，已成為近年研究的熱點問題[1-2]。

過去關于PM2.5對于人類健康的危害多聚焦于呼吸系統(tǒng)[3-4]、心血管系統(tǒng)[5-6]、癌癥[7]、免疫系統(tǒng)[8]及神經(jīng)系統(tǒng)[9]，其對于人類生殖健康危害的研究雖也有所報道，但相對較少且研究并不深入，仍在不斷地探索中。國內(nèi)一項共納入426 246名初產(chǎn)婦的研究表明，空氣中PM2.5濃度每增加10 μg/m3，孕早期發(fā)生流產(chǎn)的風險增加到1.04倍，孕中期發(fā)生流產(chǎn)的風險增加到1.02倍，孕晚期發(fā)生早產(chǎn)的風險增加到1.06倍[10]。另有國內(nèi)外文獻報道，PM2.5是新生兒低出生體質量、早產(chǎn)、胎兒生長受限、妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病和出生缺陷等不良妊娠結局的危險因素[11-12]，但其潛在機制尚不明確。本課題組前期實驗已證實PM2.5在體外可抑制人類胎盤滋養(yǎng)細胞增殖、降低其遷移與侵襲力[13-14]，而滋養(yǎng)細胞的正常增殖及功能受到侵擾則已公認與流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎盤功能不良、胎兒生長受限、妊娠期高血壓疾病等不良妊娠結局有關，找到一種對抗PM2.5抑制滋養(yǎng)細胞增殖及功能的藥物可能對保護人類生育力具有重要意義。

傳統(tǒng)中藥五子衍宗丸可以促進人類生育力，五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是其君藥五味子的主要成份。研究表明，Sch B可以降低氧化應激反應并抑制細胞的凋亡[15]。本課題組前期的研究也表明Sch B可以有效降低環(huán)境污染物苯并（a）芘對人早孕胎盤絨毛膜外滋養(yǎng)層（human trophoblast HTR-8/SVneo，HTR）細胞的毒性作用[16]。本實驗旨在探討Sch B是否可以降低PM2.5對HTR細胞增殖的抑制作用，這對于闡明Sch B是否具有預防或治療PM2.5引起的生殖毒性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料HTR細胞株由加拿大Graham教授惠贈，PM2.5（中國藥品生物制品檢定所），Sch B（中國藥品生物制品檢定所），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），小牛血清（美國GIBCO公司），胰蛋白酶（北京索萊寶生物科技公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，美國Sigma公司），MTS細胞增殖檢測試劑盒（Promega北京生物技術有限公司），細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），無菌超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司），移液器（德國Eppendorf公司），酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)HTR細胞接種于規(guī)格為10 cm的細胞培養(yǎng)皿中，給予RPMI-1640完全培養(yǎng)基7 mL后置于37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況適時進行換液、傳代、凍存及MTS細胞增殖實驗。

1.3 MTS細胞增殖實驗

1.3.1 MTS細胞增殖實驗檢測PM2.5對HTR細胞的增殖效應收集消化的HTR細胞制成單細胞懸浮溶液，將HTR細胞接種于96孔板中（每孔接種10 000個細胞），于37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后將RPMI-1640完全培養(yǎng)基更替為不同濃度的PM2.5溶液進行加藥處理，同時以0.05%DMSO溶液作為對照組，每組5個孔。繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，利用酶標儀在492 nm波長處測出每孔的OD值。

1.3.2 MTS細胞增殖實驗檢測Sch B對HTR細胞的增殖效應實驗方法與1.3.1中方法一致，不同之處在于加藥組為不同濃度的Sch B溶液。

1.3.3 MTS細胞增殖實驗檢測Sch B+PM2.5給藥對HTR細胞的增殖效應 實驗方法與1.3.1中方法一致，不同之處在于加藥組為不同濃度的Sch B+150 μg/mL濃度的PM2.5（后續(xù)表述為不同濃度的Sch B+PM2.5給藥組）。

1.4 結果計算對各組所測OD值進行計算，分析出PM2.5對HTR細胞的抑制率和Sch B的保護率。計算公式如下：

抑制率（%）=（對照組平均OD值－實驗組平均OD值）/對照組平均OD值×100%

保護率（%）=（實驗組平均OD值－對照組平均OD值）/對照組平均OD值×100%

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。定量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析方法，組間比較采用LSD法進行檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1不同濃度PM2.5對HTR細胞增殖的影響利用MTS實驗探索0.01～1 000 μg/mL范圍內(nèi)不同濃度的PM2.5作用于HTR細胞36 h后的細胞增殖情況，其中0.05% DMSO及0.01、0.1、1 μg/mL濃度的PM2.5對HTR細胞的增殖影響與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而10、100、500、1 000 μg/mL濃度的PM2.5與對照組相比均抑制了HTR細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其細胞增殖率分別是對照組的97.87%、90.20%、44.32%和24.45%。見圖1。

圖1 不同濃度PM2.5對HTR細胞增殖的影響

2.2不同濃度PM2.5對HTR細胞作用不同時間的影響根據(jù)圖1可以確定PM2.5在100～500 μg/mL范圍內(nèi)存在一個最佳染毒劑量利于后續(xù)研究Sch B的作用，故在該濃度范圍內(nèi)進一步探索不同梯度濃度的PM2.5對HTR細胞作用不同時間的增殖影響。利用100、150、200、250、300、400、500 μg/mL的PM2.5對HTR細胞作用6、12、24、36、48 h后進行MTS細胞增殖實驗，繪成細胞生長曲線，見圖2。從圖2中可以看出，在此濃度范圍內(nèi)，隨著PM2.5濃度地不斷增加，各時間點的HTR細胞增殖均受到了不同程度的抑制，且抑制率不僅隨著PM2.5濃度地增加而增大，也隨著作用時間延長而增大，但從時間上面看，作用36 h后抑制效率趨于飽和，進一步延長作用時間并未明顯增加PM2.5的抑制率。100、150、200、250、300、400、500 μg/mL的PM2.5對HTR細胞作用36 h后其細胞增殖率分別是對照組的88.75%、78.03%、65.84%、56.24%、50.06%、44.54%、40.06%。根據(jù)其抑制率，最終選擇150 μg/mL濃度的PM2.5進行后續(xù)研究。

圖2 HTR細胞在各濃度PM2.5作用不同時間下的生長曲線

2.3不同濃度Sch B對HTR細胞增殖的影響利用MTS實驗探索0.01～1 000 μmol/L范圍內(nèi)不同濃度的Sch B作用HTR細胞36 h后的細胞增殖情況，0.01、0.1、1、10、100、500、1 000 μmol/L濃度的Sch B作用后其細胞增殖率分別是對照組的99.74%、99.80%、101.00%、97.26%、89.01%、84.32%、80.41%。其中，0.01、0.1、1 μmol/L濃度的Sch B與對照組相比，增殖率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而10、100、500、1 000 μmol/L濃度的Sch B組細胞增殖率與對照組相比均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 不同濃度Sch B對HTR細胞增殖的影響

取0.1～10 μmol/L濃度范圍的Sch B作用HTR細胞36 h后的細胞增殖情況如圖4所示，0.1、0.25、0.5 μmol/L濃度的Sch B對HTR細胞的增殖率分別為對照組的99.80%、100.20%、100.59%，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；1、2 μmol/L濃度的Sch B的細胞增殖率分別為對照組的101.00%、102.37%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；5、10 μmol/L濃度的Sch B組其細胞增殖率分別為對照組的100.90%、97.26%，前者與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），后者與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖4 進一步探索Sch B對HTR細胞增殖的影響

2.4 Sch B降低了PM2.5對HTR細胞增殖的抑制作用如圖5所示，0.1～10 μmol/L范圍內(nèi)不同濃度的Sch B和150 μg/mL濃度的PM2.5聯(lián)合給藥作用HTR細胞36 h后，各組的細胞增殖率分別為對照組的78.03%、79.36%、80.17%、84.20%、86.07%、89.01%、81.72%、74.43%，與對照組相比，各組的細胞增殖均受到了不同程度的抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；但是與150 μg/mL PM2.5單獨給藥組（簡稱PM2.5單獨給藥組）相比，濃度為0.25、0.5、1、2、5 μmol/L的Sch B+PM2.5給藥組則促進了HTR細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），濃度為10 μmol/L的Sch B+PM2.5給藥組則進一步抑制了HTR細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而0.1 μmol/L的Sch B+PM2.5給藥組與PM2.5單獨給藥組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。進一步分析各濃度Sch B降低PM2.5對HTR細胞的抑制效率如圖6所示，與單獨PM2.5給藥組相比，0.1、0.25、0.5、1、2、5 μmol/L的Sch B+PM2.5給藥組的細胞保護率分別為1.70%、2.74%、7.90%、10.30%、14.07%、4.73%；10 μmol/L的Sch B+PM2.5給藥組的細胞增殖率為PM2.5單獨給藥組的95.39%。

圖5 各濃度Sch B聯(lián)合PM2.5給藥對HTR細胞增殖的影響

圖6 各濃度Sch B聯(lián)合PM2.5給藥與PM2.5單獨給藥的對比

3 討論

受精卵早在發(fā)育到囊胚時已分化出滋養(yǎng)細胞，而滋養(yǎng)細胞具有侵蝕性，對于受精卵的著床、胚胎植入、胎盤形成及母血交換等過程至關重要，其功能的異常往往引起流產(chǎn)、胚胎停育、早產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病等不良妊娠結局，故有學者認為其是維持胚胎生長發(fā)育的核心單元[17-18]。本研究直接以HTR細胞為研究對象，對于闡釋環(huán)境污染物PM2.5的生殖毒性具有直觀可靠的優(yōu)勢。

本研究利用MTS細胞增殖實驗檢測PM2.5在體外對HTR細胞增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)0.05%DMSO及0.01、0.1、1 μg/mL濃度的PM2.5不影響HTR細胞的增殖，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但10、100、500、1 000 μg/mL濃度的PM2.5均不同程度抑制了HTR細胞的增殖（P＜0.01），這說明溶解PM2.5的溶劑0.05%DMSO本身并不抑制細胞增殖，但PM2.5濃度達到一定的水平則會抑制HTR細胞的增殖，即可造成細胞毒性。為了尋找PM2.5的最佳毒性作用以利于后續(xù)研究，本研究將PM2.5濃度細分為100、150、200、250、300、400、500 μg/mL七個濃度梯度，并均對HTR細胞進行6、12、24、36、48 h的染毒，以觀察HTR細胞在不同濃度梯度的PM2.5不同作用時間下的細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)100～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)的PM2.5在各個時間點對HTR細胞均有抑制作用，其抑制作用在該濃度范圍內(nèi)隨著PM2.5濃度的增加而增加，也隨著作用時間的延長而增加，但作用36 h后抑制作用趨于飽和。通過分析發(fā)現(xiàn)150 μg/mL濃度的PM2.5作用HTR 細胞36 h 后細胞增殖率為對照組的78.03%，這個抑制率較為理想，適合后續(xù)研究，故后續(xù)實驗中以此濃度進行HTR細胞的染毒。這再次明確了PM2.5對HTR細胞的體外直接毒性作用。

本研究還利用MTS細胞增殖實驗驗證Sch B本身對HTR細胞是否具有毒性作用，結果顯示，0.01～1 μmol/L濃度的Sch B并未抑制HTR細胞的增殖，0.25、0.5、1、2、5 μmol/L濃度的Sch B對HTR細胞還有輕微的促增殖作用，且在0.25～2 μmol/L濃度范圍內(nèi)其促增殖作用隨著劑量增加而輕微增加，但是10、100、500、1 000 μmol/L濃度的Sch B則均抑制了HTR細胞的增殖，即產(chǎn)生了細胞毒性，這說明適量濃度范圍內(nèi)的Sch B（≤5 μmol/L）本身不會對HTR細胞增殖產(chǎn)生抑制作用，反而0.25～5 μmol/L濃度范圍內(nèi)可以促HTR細胞增殖。之后將0.1～10 μmol/L濃度Sch B與150 μg/mL濃度的PM2.5共同培養(yǎng)36 h。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，雖然各組的增殖均受到不同程度的抑制，但是與單獨150 μg/mL PM2.5給藥組相比，0.1、0.25、0.5、1、2、5 μmol/L的Sch B+PM2.5給藥組則促進了HTR細胞的增殖，即降低了PM2.5的抑制作用，且在0.1～2 μmol/L濃度范圍內(nèi)其降低PM2.5抑制HTR細胞增殖作用隨著劑量增加而增加。但需注意10 μmol/L的Sch B+PM2.5給藥組則增強了PM2.5的抑制HTR增殖作用，這可能與10 μmol/L的Sch B本身就具有細胞增殖抑制作用有關。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，0.1、0.25、0.5、1、2、5 μmol/L的Sch B+PM2.5給藥組的細胞保護率分別為1.70%、2.74%、7.90%、10.30%、14.07%、4.73%，保護效果明確有效。

需要說明的是，據(jù)文獻報道，目前我國污染最嚴重的中東部城區(qū)環(huán)境監(jiān)測站實測PM2.5濃度可高達500～700 μg/m3，遠高于世界衛(wèi)生組織的標準[19]，但是與本研究的有效濃度差距仍然較大，這并不能說明目前我國污染嚴重的地區(qū)不會帶來人類生殖毒性，原因在于本研究主要為體外實驗，需要在短時間內(nèi)觀察細胞的增殖變化，故PM2.5的作用濃度會大大增加，而環(huán)境中PM2.5則會長期存在，即使小劑量也會對人體起到“潛移默化”的影響，所以這也是本研究的不足之處，即雖然證實了PM2.5對HTR的毒性，但并不能僅利用HTR細胞的體外試驗就充分說明PM2.5的生殖毒性，還需要體內(nèi)試驗的充分佐證。

此外，本研究利用體外實驗還證實了Sch B可以降低PM2.5對HTR細胞增殖的抑制作用，這與已有的研究證實Sch B作為抗氧化應激、抗凋亡信號通路的激動劑在保護HTR細胞遭受的環(huán)境污染物苯并（a）芘毒性相一致[20-21]，這為降低PM2.5的毒性從而保護滋養(yǎng)細胞的生殖健康提供了新的用藥思路，但Sch B實現(xiàn)這一保護人類生殖健康的潛在分子機制以及信號通路尚不明確，本課題組仍在探索中，也希望可以進一步開發(fā)出相關藥物保護和促進人類生殖健康。