王 樂(綜述)， 張志強(qiáng)， 陳建松， 陳 卓(審校)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs) 是指脫離原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移部位并存在于外周血中循環(huán)的各類腫瘤細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致治療失敗的根源[1]。CTCs代表原發(fā)腫瘤的表型和遺傳組成，其類型和數(shù)量變化與腫瘤動態(tài)密切相關(guān)，是轉(zhuǎn)移性癌癥如乳腺癌、前列腺癌等的預(yù)測指標(biāo)[2-3]。2007年，美國臨床腫瘤協(xié)會(American society of clinical oncology, ASCO)將CTCs納入腫瘤標(biāo)志物。

雖然CTCs很早就被發(fā)現(xiàn)[4]，但直至上世紀(jì)末尤其是本世紀(jì)初，隨著分子生物學(xué)、計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，以及免疫標(biāo)記技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，CTCs的分離檢測技術(shù)才得到迅速發(fā)展。大量研究表明，CTCs以不同形態(tài)存在于外周血中，既有游離的單個CTC，也有聚集成團(tuán)的細(xì)胞團(tuán)。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在進(jìn)入外周血循環(huán)的過程中會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[5]，即上皮細(xì)胞來源的實體腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞在特定條件下通過特定程序失去細(xì)胞極性，失去與基底膜連接等上皮表型，并轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。因此，CTCs存在不同類型，包括上皮細(xì)胞表型、間質(zhì)細(xì)胞表型和上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞混合表型，既表現(xiàn)表皮細(xì)胞特性，又表現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞特性，呈現(xiàn)出原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的混合細(xì)胞狀態(tài)[6]。值得注意的是，通過EMT，實體瘤上皮細(xì)胞發(fā)生變化，增加了流動性和侵襲性，易脫離組織進(jìn)入血液，最后發(fā)展為遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。隨著癌癥患者對治療藥物耐藥性的產(chǎn)生，其血液中的CTCs越來越多表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞特性[6]。由此可見，CTCs的EMT(CTCs-EMT)程度不僅可監(jiān)測腫瘤動態(tài)、評估治療效果，也可用于復(fù)發(fā)風(fēng)險評估，有助于實現(xiàn)實時個體治療。

1 CTCs-EMT與腫瘤增殖

在過去的幾十年中，腫瘤患者外周血中CTCs的檢測已經(jīng)獲得越來越多的關(guān)注。源自原發(fā)性腫瘤灶的具有高度侵襲性的腫瘤細(xì)胞不斷增殖，它們離開原發(fā)腫瘤灶、進(jìn)入外周血后就成為具有侵襲和轉(zhuǎn)移潛能的CTCs。已有研究證實[7]，CTCs-EMT是一種細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化過程，與腫瘤的增殖密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為：(1)形態(tài)改變：細(xì)胞由鵝卵石樣變?yōu)榧忓N體樣，細(xì)胞極性喪失，骨架改變，浸潤與遷移能力增強(qiáng)。(2)分子標(biāo)志物改變：上皮化分子標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等表達(dá)水平下降，間質(zhì)化分子標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)等表達(dá)水平上升。許多研究已經(jīng)建立了EMT和各型CTCs形成之間的聯(lián)系，如在對乳腺癌患者血液CTCs的水平監(jiān)測中，發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展的乳腺癌患者，形成細(xì)胞團(tuán)簇的CTCs主要為間質(zhì)表型，其分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，協(xié)同血液循環(huán)中FOXC1轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)CTCs-EMT[8]。EMT現(xiàn)象也存在于原發(fā)性肝癌患者外周血CTCs中，肝癌患者外周血樣CTCs-EMT的含量與其預(yù)后密切相關(guān)[9-10]。因此，外周血CTCs-EMT檢測有望成為診斷原發(fā)性肝癌的新型生物標(biāo)記物。此外，經(jīng)過根治性切除原發(fā)性腫瘤并接受化學(xué)藥物治療或放射治療的癌癥患者，其體內(nèi)依然存在微小瘤灶或微量腫瘤細(xì)胞[11-12]，這些腫瘤細(xì)胞在一定時間范圍內(nèi)可進(jìn)入休眠，但仍具增殖潛能，可在數(shù)年乃至數(shù)十年后再次增殖，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。

2 CTCs-EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移

大約90%腫瘤患者的死亡是因腫瘤轉(zhuǎn)移造成的。因此，腫瘤轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的最主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移的過程主要包括：原發(fā)瘤對鄰近組織的侵襲、CTCs產(chǎn)生、CTCs遷徙入血、CTCs在循環(huán)中生存、CTCs在遠(yuǎn)隔部位滲出血管并定植形成轉(zhuǎn)移灶、轉(zhuǎn)移灶的二次轉(zhuǎn)移。CTCs在循環(huán)系統(tǒng)中一般只能維持?jǐn)?shù)秒至數(shù)分鐘。大部分CTCs進(jìn)入血循環(huán)后隨即凋亡，但有些CTCs(不足0.01%)通過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)遠(yuǎn)處組織，形成新的腫瘤。相對于單個CTC，CTCs聚集成團(tuán)的形式可使其抵御其他細(xì)胞(如自然殺傷細(xì)胞)攻擊的能力增強(qiáng)，不僅能有效抵抗凋亡，而且有助于其駐留在微血管腔內(nèi)(微血管腔的直徑達(dá)8 μm就能捕獲CTCs)。CTCs聚集成團(tuán)，由于細(xì)胞之間通過黏附的形式首尾相連，形成單細(xì)胞鏈的方式通過微血管腔，有助于其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

早在2013年，Yu等[13]通過對乳腺癌患者的CTC動態(tài)監(jiān)測和CTC的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的CTCs通過EMT途徑增加轉(zhuǎn)移和侵略性，并表示間質(zhì)型CTC與疾病進(jìn)展有關(guān)。之后越來越多的臨床研究發(fā)現(xiàn)：晚期癌癥患者的CTCs更傾向于表達(dá)波形蛋白、纖連蛋白、N-鈣黏蛋白和O-鈣粘蛋白等CTCs-EMT相關(guān)蛋白[14-15]。如結(jié)直腸癌患者的CTCs中，上皮間質(zhì)混合型及間質(zhì)型的占比程度與患者的臨床分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[16]；晚期原發(fā)性肝癌患者的CTCs中，間質(zhì)型CTCs的占比高，而上皮型或上皮-間質(zhì)混合型CTCs的占比與早期肝癌患者并無顯著差異[17]；惡性上皮性卵巢癌患者的CTCs-EMT具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，增加其侵襲性[18]。這些腫瘤細(xì)胞發(fā)生CTCs-EMT過程涉及到許多分子水平和細(xì)胞水平的變化，如上皮細(xì)胞蛋白(如E-鈣黏蛋白，閉合蛋白和細(xì)胞角蛋白)水平下調(diào)、間質(zhì)細(xì)胞蛋白(如N-鈣黏蛋白，纖連蛋白和波形蛋白)水平上調(diào)等。其中，E-鈣黏蛋白是CTCs-EMT或其逆過程——間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial, MET)發(fā)生的重要調(diào)控者。這些蛋白表達(dá)水平的改變可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞絲狀偽足形成，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移以及在不利環(huán)境中的生存能力[19-20]。

3 CTCs-EMT與腫瘤耐藥

化學(xué)藥物治療是目前治療惡性腫瘤的重要手段之一。然而，腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥最終導(dǎo)致化療失敗。通過對130例患者化療前后的血樣分析發(fā)現(xiàn)，化學(xué)療法導(dǎo)致癌癥干細(xì)胞和具有EMT特征的CTCs的數(shù)量顯著增加，直接影響了總體生存期[21]。其中，具有EMT特征的CTCs具有化療耐受性，可獨立預(yù)示轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后不良。此外，在Ⅰ期及Ⅲ期原發(fā)性乳腺癌患者中，接受新輔助治療(即在術(shù)前進(jìn)行化療，達(dá)到縮小腫瘤的目的)患者的CTCs-EMT誘導(dǎo)的多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，包括Twist相關(guān)蛋白1(TWIST1)、SNAIL1、SLUG、ZEB1和FOXC2的表達(dá)均顯著提高[22]。這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其中有些轉(zhuǎn)錄因子之間可以相互作用，直接激活下游轉(zhuǎn)錄因子的啟動序列，共同促進(jìn)CTCs-EMT轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥產(chǎn)生等。因此，抑制CTCs-EMT有助于提高腫瘤患者對化療藥物的敏感性，延長患者的生存期。

4 CTCs-EMT檢測及其臨床應(yīng)用

采集于液體活檢樣本的CTCs實時監(jiān)測，是監(jiān)控治療效果和調(diào)整治療方案的重要依據(jù)，有助于針對腫瘤患者制定精準(zhǔn)治療方案，用于指導(dǎo)腫瘤靶向治療。由于CTCs在外周血中的含量極為稀少(一般認(rèn)為，外周血中105～107個單核細(xì)胞中才有1個CTC)，因此，對CTCs檢測的靈敏度和特異性提出了極高的要求。目前針對CTCs的分離檢測技術(shù)主要分為：根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物的免疫捕獲法進(jìn)行陽性富集法(如CellSearchTM系統(tǒng)、CTC-chip及MACS?Cell Separation磁性細(xì)胞分選系統(tǒng))和陰性篩選法(如Easy Sep和Cyttel/Cytelligen檢測系統(tǒng))；根據(jù)細(xì)胞大小的濾膜過濾法分離上皮源腫瘤細(xì)胞(ISET)以及根據(jù)細(xì)胞密度的密度梯度離心法[23](如OncoQuick分離體系，表1)。其中，美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration, FDA)批準(zhǔn)了用于多種癌癥(如轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等)CTCs臨床檢測的CellSearchTM自動化系統(tǒng)，就是基于上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)在上皮細(xì)胞和上皮腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平的差異[24]，利用EpCAM抗體對CTCs進(jìn)行捕獲富集后檢測的產(chǎn)品。Guo等[25]借助稀土納米粒子的溶解增強(qiáng)熒光放大技術(shù)和長壽命的稀土離子配合物熒光信號，發(fā)展了一種靶向上皮腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的EpCAM，并有效克服血液樣品中復(fù)雜短壽命背景熒光信號的干擾，實現(xiàn)對全血CTCs的直接檢測。

表1 目前常見的CTCs檢測技術(shù)比較Tab.1 Comparison of common CTCs detection technologies

與CTCs比較，CTCs-EMT不僅在細(xì)胞形態(tài)和移動性上均有所改變，其細(xì)胞基因表達(dá)譜往往會出現(xiàn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物[如EpCAM和細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)]的下調(diào)及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[如細(xì)胞表面波形蛋白(cell surface vimentin, CSV)]和轉(zhuǎn)錄因子twist1]的上調(diào)[26]，即僅通過EpCAM抗體富集CTCs的檢測手段無法檢測CTCs-EMT，從而導(dǎo)致假陰性。

由于CTCs-EMT具有高表達(dá)N-鈣黏蛋白的特性，具有選擇性及競爭性結(jié)合N-鈣黏蛋白并阻斷其活性的環(huán)五肽化合物exherin(ADH-1)備受關(guān)注。借助納米粒與環(huán)五肽化合物ADH-1偶聯(lián)，可顯著下調(diào)N-鈣黏蛋白水平，并對腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有抑制作用[27]。利用環(huán)五肽化合物ADH-1構(gòu)建該多肽修飾的脂質(zhì)體具有抑制N-鈣黏蛋白活性，可有效遏制腫瘤細(xì)胞遷移，并恢復(fù)耐藥腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的作用[28]。這些研究結(jié)果提示：CTCs-EMT與腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)具有密切聯(lián)系，有望成為腫瘤CTCs檢測的新的補(bǔ)充靶點。

在對臨床癌癥患者外周血的分析中發(fā)現(xiàn)：發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸直腸癌患者，其外周血CTCs-EMT高表達(dá)具有重要預(yù)后評估價值的標(biāo)志物Plastin 3(PLS3)[29]；在前列腺癌患者的外周血樣中，其CTCs-EMT細(xì)胞表面高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CSV[30]。借助上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物(EpCAM，CK8/18/19，CSV和Twist1)可對來自肝癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及非小細(xì)胞肺癌患者的CTCs進(jìn)行表征，并可區(qū)分上皮CTCs、生物表型上皮/間質(zhì)CTCs和間質(zhì)CTCs[31]。Po等[32]也證實：聯(lián)合間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和上皮細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM富集晚期卵巢癌患者血液中的CTCs，比單獨使用EpCAM的富集效率明顯提高，而且利用細(xì)胞表達(dá)的N-鈣黏蛋白可成功捕獲CTCs-EMT。Zeinali等[33]通過一種慣性微流迷宮裝置(inertial microfluidic Labyrinth device)對轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者的CTC/CTC簇進(jìn)行高通量分析?；诩?xì)胞大小檢測不同CTC群體，包括表達(dá)上皮(EpCAM)，間充質(zhì)或兩種標(biāo)記的CTCs；發(fā)現(xiàn)大部分患者的CTCs中75%是EpCAM陰性CTCs。因此，有理由認(rèn)為，聯(lián)合間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物和上皮細(xì)胞標(biāo)志物的檢測手段能有效降低或減免假陰性結(jié)果(圖1)。

CTCs:循環(huán)腫瘤細(xì)胞; EMT:上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。圖1 CTCs-EMT檢測示意圖Fig.1 Schematic diagram of CTCs-EMT detection

5 展 望

CTCs-EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及腫瘤耐藥性產(chǎn)生等方面均發(fā)揮重要作用，有關(guān)CTCs-EMT的基礎(chǔ)和臨床治療研究已成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。作為一個新的研究領(lǐng)域，無疑有大量未知問題亟待解決：如何篩選或鑒定出高特異性及高靈敏性的CTCs-EMT標(biāo)志物及其在不同類型CTCs中的表達(dá)譜；如何研發(fā)適于臨床CTCs-EMT檢測技術(shù)；如何建立CTCs-EMT腫瘤轉(zhuǎn)移模型等。顯然，深入研究CTCs-EMT產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化機(jī)制有助于理解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移進(jìn)程。同時，提高CTCs-EMT檢測的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，將對癌癥患者的預(yù)后評估具有重大現(xiàn)實意義，同時也為制定個體化精準(zhǔn)治療策略提供重要依據(jù)。