胡 駿， 施 斌， 陳艷文， 丁玉梅

骨作為人體重要的硬組織，具有極其復(fù)雜的多級結(jié)構(gòu)，使得其展現(xiàn)出優(yōu)異的機(jī)械性能和生物性能[1]。人體骨組織是以膠原為主的有機(jī)相和以納米羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)為主的無機(jī)相共同組成的多級微/納米結(jié)構(gòu)[2-3]。從生物仿生學(xué)角度看，由多級微米級及納米級形貌復(fù)合所形成的獨特表面形貌能更加有效地模擬自然狀態(tài)下的骨形態(tài)及骨功能。研究表明，材料表面的形貌和成分對植入人體后蛋白吸附及細(xì)胞的粘附、生長、增殖、分化等功能有著較大的影響[4-7]。因此，構(gòu)造一種具有多級微/納米形貌及生物活性表面，對于骨組織的生長和形成骨整合，實現(xiàn)材料植入后的短期負(fù)載和長期安全有著積極的意義。

本研究擬在純鈦表面采用噴砂酸蝕的方式構(gòu)筑多級微米形貌，在保留多級微米表面的同時通過陽極氧化形成納米級的微結(jié)構(gòu)，通過電化學(xué)沉積及熱處理調(diào)控沉積形成具有生物活性的HA涂層，構(gòu)筑多級微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)HA涂層，優(yōu)化鈦表面生物活性，促進(jìn)鈦植入體表面與骨組織的骨整合。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 TA4鈦片(大博醫(yī)療科技股份有限公司)；人成骨細(xì)胞MG-63(廈門大學(xué)陳清西實驗室惠贈)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(德國PAA公司)；0.25%胰酶消化液(美國Gibco公司)；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1分組 選用TA4鈦片(1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm)，依次采用320#、1000#氧化鋁砂紙逐級打磨至表面平整無毛刺，依次置于丙酮、乙醇、去離子水中超聲清洗10 min，在含有HNO3及HF的水溶液中酸洗2 min，去離子水沖洗，烘干至恒重，待用。將研究樣品分為4組：

1.2.1.1酸洗(PT組) HNO3∶HF=150 mL/L∶40 mL/L的水溶液中酸洗2 min。

1.2.1.2表面噴砂酸蝕(SLA組) 酸洗后，噴砂及混合酸處理工藝同文獻(xiàn)方法[8]，即采用180目(0.08 mm)Al2O3噴砂后，于硫酸/鹽酸的混合液中60 ℃下酸蝕30 min。

1.2.1.3SLA-A組 酸洗后，噴砂及混合酸處理，隨后進(jìn)行陽極氧化處理(20 V電壓，濃度0.3%HF，陽極氧化6 min)。

1.2.1.4SLA-A-E-H組 噴砂酸蝕陽極氧化后，以樣片為陰極進(jìn)行恒電流電化學(xué)沉積[Ca(NO3)2∶NH4H2PO4=1.68∶1，沉積電流：2×10-2A/cm2，55 ℃，60 min]，隨后置于管式加熱爐中加熱處理(500 ℃，升溫速率8 ℃/min，保溫3 h)，冷卻至室溫，此處理定義為SLA-A-E-H組。

1.2.2表面形貌及表征分析 采用SEM對材料表面進(jìn)行形貌觀察；采用掃描電鏡LEO1530所附帶的Oxford能量散色光譜儀進(jìn)行成分表征和結(jié)晶相測試；采用X射線衍射儀進(jìn)行涂層結(jié)構(gòu)成分測試；采用拉曼光譜儀和衰減全反射傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行表面紅外光譜表征分析。

1.2.2.1 菌株DNA提取過程（1）稱取純種麩曲0.5 g，置于2 mL離心管中。（2）向離心管中加入1 mL裂解液，漩渦充分混勻。

1.2.3粗糙度及親水性分析 采用表面粗糙度儀對材料表面進(jìn)行粗糙度表征；采用光學(xué)接觸角測量儀進(jìn)行表面接觸角測試。樣品處理后放置5 d，再進(jìn)行親水性測試表征。

1.2.4體外生物活性研究 采用體外礦化實驗進(jìn)行體外生物活性測試，使用的模擬體液(simulated body fluid, SBF)參考Kokubo[9]的配方及方法，采用Millipore公司Milli-Q型制備的膜過濾超純水。配制方法為恒溫水浴(36.5±1.5)℃條件下，依次按順序逐一溶解相應(yīng)溶質(zhì)后，用1.0 mol/L的HCl和Tris溶液調(diào)節(jié)pH值=7.40，定容。樣品浸泡SBF，溶液體積量為50 mL，恒溫水浴36.5 ℃下浸泡7 d后取出，用去離子水沖洗后干燥待用。

1.2.5成骨細(xì)胞粘附實驗 將處理完的樣品置于12孔板內(nèi)，每個孔內(nèi)放1個樣品。取生長對數(shù)期的成骨細(xì)胞MG-63，用PBS溶液洗滌2次，0.25%胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔1×105接種于12孔板內(nèi)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。樣品用0.1 mol/L預(yù)冷的PBS沖洗3次；2.5%戊二醛4 ℃下固定2 h后，0.1 mol/L 預(yù)冷的PBS沖洗3次；分別以30%，50%，70%，90%及100%的乙醇依次梯度脫水，每次10 min；最后過渡到100%叔丁醇中，4 ℃過夜結(jié)晶；冷凍干燥后，噴金處理，掃描電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1表面形貌和成分分析 采用SEM對PT、SLA、SLA-A、SLA-A-E-H 4種不同方法處理的鈦片樣品進(jìn)行表面形貌表征(圖1)。PT組表面形成略帶起伏、無細(xì)微結(jié)構(gòu)的平整表面；SLA組表面形成孔徑為5～8 μm及20～30 μm、有一定深度的多級微米孔洞；SLA-A組表面在保留多級微米孔洞的同時，原位形成10 nm的管狀納米形貌；SLA-A-E-H組在多級微納米表面鋪展了一層寬30～50 nm、長100～200 nm納米梭形顆粒所組成的膜層，即擁有多級微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的表面涂層。表面元素分析結(jié)果顯示，PT組和SLA組表面元素種類無變化，SLA-A組表面出現(xiàn)氧元素，SLA-A-E-H組表面不僅引入氧元素，還有鈣和磷元素(圖2)。

A,B：酸洗；C,D：噴砂酸蝕；E,F：陽極氧化；G,H：電化學(xué)沉積羥基磷灰石及熱處理。A，C，E，G：×3 000；B，D，F(xiàn)，H：×30 000。圖1 不同方法處理后的表面掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of surface treated in different ways

A：酸洗；B：噴砂酸蝕；C：陽極氧化；D：電化學(xué)沉積羥基磷灰石及熱處理。圖2 鈦表面經(jīng)過不同處理后表面能譜分析譜圖Fig.2 EDS of surface treated in different way

2.2表面晶型分析 X射線衍射分析結(jié)果如圖3所示。PT及SLA組的衍射與鈦(JCPDS#89-5009)的標(biāo)準(zhǔn)卡片相符，表明表面無其他膜層覆蓋，為純鈦基體表面。酸蝕后(102)晶面及(110)晶面分別存在一定減弱和增強(qiáng)，說明酸蝕存在一定程度的特異性腐蝕，在2θ=59.2°出現(xiàn)明顯的衍射峰，為析氫產(chǎn)生的TiH2物相。SLA-A組由于生成的二氧化鈦無定形，故僅有鈦基體的峰存在。

a：酸洗；b：噴砂酸蝕；c：陽極氧化；d：電化學(xué)沉積羥基磷灰石及熱處理。圖3 不同處理后樣品的X射線衍射譜圖Fig.3 XRD patterns of the surface treated in different ways

2.3表面紅外圖譜及拉曼光譜分析 PT、SLA及SLA-A組的紅外譜圖基本無明顯變化(圖4A)，僅SLA-A-E-H組在3 400 cm-1處可見微弱的峰，同時在1 026 cm-1處出現(xiàn)一個峰型尖銳的強(qiáng)峰，對應(yīng)為磷灰石PO43-的反對稱伸縮振動峰(ν3)[10]，而SLA-A-E-H表面特征峰不明顯。

A：紅外譜圖；B：拉曼譜圖。PT：酸洗；SLA：噴砂酸蝕；SLA-A：陽極氧化；SLA-A-E-H：電化學(xué)沉積羥基磷灰石及熱處理。圖4 不同處理樣品的紅外及拉曼譜圖Fig.4 ATR-FTIR and Raman spectra of different surface treatments(PT, SLA, SLA-A, SLA-A-E-H)

4種樣品的拉曼譜圖如圖4B所示。PT、SLA、SLA-A組均無明顯的拉曼峰出現(xiàn)，SLA-A-E-H組在148，198，395，518及640 cm-1處出現(xiàn)較明顯的銳鈦礦特征譜峰，同時在448及830 cm-1處出現(xiàn)金紅石的特征譜峰[11]。

2.4粗糙度比較 酸洗后PT， SLA，SLA-A及SLA-A-E-H組的表面粗糙度分別為(0.62±0.02)，(1.65±0.16)，(1.64±0.06)及(1.63±0.05)μm(圖5)。統(tǒng)計顯示，PT組與其他組(SLA, SLA-A, SLA-A-E-H)的差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SLA，SLA-A及SLA-A-E-H組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

PT：酸洗；SLA：噴砂酸蝕；SLA-A：陽極氧化；SLA-A-E-H：電化學(xué)沉積羥基磷灰石及熱處理。與PT組比較，△：P<0.05。圖5 不同處理后的樣品表面粗糙度Fig.5 Surface roughness of samples after different treatments

2.5接觸角比較 PT，SLA，SLA-A及SLA-A-E-H組的測試接觸角分別為(68.0±0.4)°，(88.7±2.1)°，(134.2±2.7)°及(60.4±0.45)°(圖6)。

A：酸洗；B：噴砂酸蝕；C：陽極氧化；D：電化學(xué)沉積羥基磷灰石及熱處理。圖6 不同處理后的樣品接觸角Fig.6 Contact angle of samples after different treatments

2.6體外生物活性研究-體外礦化實驗 PT，SLA及SLA-A組表面均無礦化結(jié)晶產(chǎn)生，僅SLA-A-E-H組表面礦化生成大量的沉淀物(圖7)。

A：酸洗；B：噴砂酸蝕；C：陽極氧化；D：電化學(xué)沉積羥基磷灰石及熱處理。圖7 不同處理后的樣品浸泡SBF溶液7 d后掃描電鏡圖(×10 000)Fig.7 SEM images of samples treated in different ways soaking in SBF for 7 d(×10 000)

為確定礦化物質(zhì)的性質(zhì)，對SLA-A-E-H組浸泡7 d 的表面涂層進(jìn)行成分表征分析及元素含量分析。表面礦化物由鈣、磷、氧元素組成，其中鈣磷比約為2.0～2.2，大于羥基磷灰石的鈣磷比理論值1.67(表1)。

表1 SLA-A-E-H樣品SBF浸泡7 d后表面成分Tab.1 Composition of SLA-A-E-H soaking in SBF for 7 d

為進(jìn)一步確定其礦化成分，對上述SLA-A-E-H浸泡前及浸泡7 d后的樣品進(jìn)行XRD及ATR-FTIR表征。浸泡前在2θ=25.2°,27.4°,32.1°及其他位置分別對應(yīng)金紅石、銳鈦礦、微弱的HA峰及鈦基體的特征衍射峰，浸泡后金紅石和銳鈦礦的峰基本消失，但在2θ=25.9°及32.1°附近出現(xiàn)明顯的羥基磷灰石的衍射峰[13](圖8A)。

對上述樣品進(jìn)行ATR-FTIR測試表征(圖8B)。浸泡前在1 025 cm-1處出現(xiàn)較弱的磷灰石PO43-的反對稱伸縮振動峰(ν3)，同時在3 570 cm-1處出現(xiàn)OH-的伸縮振動。浸泡后，在1 025 cm-1處對應(yīng)磷酸根的峰面積均有較大程度增加[14]。此外，SBF浸泡常伴隨CO32-的取代，紅外光譜定性檢測可見1 420 cm-1處出現(xiàn)CO32-的紅外吸收峰。

SLA-A-E-H：電化學(xué)沉積羥基磷灰石及熱處理；XRD：X射線衍射；ATR-FTIR：紅外光譜;SBF:模擬體液。A：XRD；B：ATR-FTIR。圖8 SLA-A-E-H樣品模擬體液浸泡前后的XRD及ATR-FTIRFig.8 XRD and ATR-FTIR image of SLA-A-E-H soaking in SBF

2.7體外細(xì)胞粘附實驗 PT組表面的細(xì)胞大小約為20 μm，細(xì)胞周圍存在大量偽足，微絨毛很少。SLA組明顯可見噴砂酸蝕形成的多級微米結(jié)構(gòu)上粘附大量的成骨細(xì)胞，細(xì)胞呈多邊形，微絨毛較PT組有較大程度的增加，放大后可見細(xì)胞偽足吸附在微米孔洞中。SLA-A組保留多級微米形貌的同時形成微小納米結(jié)構(gòu)，與SLA組表面細(xì)胞形態(tài)基本相同，存在大量偽足。相比之下，其偽足和微絨毛進(jìn)一步增加。SLA-A-E-H組表面的表征形態(tài)與SLA-A及SLA-A-H組相似，但其微小絨毛的數(shù)量顯著增加(圖9)。

A,B：酸洗;C,D：噴砂酸蝕; E,F：陽極氧化;G,H：電化學(xué)沉積羥基磷灰石及熱處理。A，C，E，G：×1 000；B，D，F(xiàn)，H：×10 000。圖9 不同處理后的樣品細(xì)胞培養(yǎng)3 d后的掃描電鏡圖Fig.9 SEM images of samples treated in different ways for 3 d

3 討 論

根據(jù)鈦片表面形貌尺度不同，表面形態(tài)可分為微米級、納米級，不同的表面形貌對植入材料與細(xì)胞、蛋白之間的生物行為有一定的調(diào)控作用。通常微米形貌可通過噴涂、噴砂、酸蝕等方法制備，納米形貌則可通過自組裝、化學(xué)浸泡NaOH或H2O2陽極氧化等方法獲得。研究表明，微米表面對植入體的植入效果有一定的影響：如增加材料與骨的基礎(chǔ)面積，利于細(xì)胞粘附，改變細(xì)胞的組織行為，增加植入體與骨之間的機(jī)械鎖合以及促進(jìn)植入毗連區(qū)的炎癥反應(yīng)利于其愈合等。納米結(jié)構(gòu)則通過增加或改變蛋白的吸附行為，影響細(xì)胞的相互作用，從而間接影響細(xì)胞的行為，促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附、增殖、分化以及骨的形成，在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞某些功能的實現(xiàn)。

本研究在平整純鈦表面，選用4種方法(PT，SLA，SLA-A及SLA-A-E-H組)進(jìn)行處理，獲得不同的表面形貌。對這4種表面涂層采用能譜分析進(jìn)行成分表征，結(jié)果顯示，PT及SLA組表面無其他元素的能譜峰，SLA-A組出現(xiàn)一定含量的氧元素，說明陽極氧化處理在表面形成相應(yīng)鈦的氧化物；SLA-A-E-H組除了鈦的氧化物，還存在一定含量的鈣、磷元素，其中鈣原子含量略高于磷，說明沉積的梭形納米顆粒為含有鈣、磷等元素的鈣磷鹽。SLA-A-E-H組在2θ=25.2°及27.4°出現(xiàn)兩個較強(qiáng)的衍射峰，說明通過熱處理，可在表面形成相應(yīng)的銳鈦礦和金紅石的結(jié)晶氧化鈦層；同時，發(fā)現(xiàn)SLA-A-E-H組在2θ=32.1°存在一個較微弱的衍射峰，與標(biāo)準(zhǔn)HA的衍射數(shù)據(jù)(JCPDS#01-1008)相吻合，表明生成的成分為HA，但其結(jié)晶度較低。

表面紅外圖譜分析結(jié)果顯示，PT，SLA及SLA-A組紅外譜圖基本無明顯變化，僅SLA-A-E-H組在3 400 cm-1處出現(xiàn)微弱的峰，說明有締合的羥基紅外吸收峰，同時在1 026 cm-1處出現(xiàn)一個峰型尖銳的強(qiáng)峰，對應(yīng)為磷灰石PO43-的反對稱伸縮振動峰(ν3)[10]；而SLA-A-E-H表面特征峰不明顯，說明形成HA的結(jié)晶性相對較低，結(jié)果與X射線衍射數(shù)據(jù)一致。

拉曼譜圖譜結(jié)果顯示，PT，SLA及SLA-A組均無明顯的拉曼峰出現(xiàn)，SLA-A-E-H組有較明顯的銳鈦礦特征譜峰，同時在448 及830 cm-1處出現(xiàn)了金紅石的特征譜峰[11]，與X射線衍射數(shù)據(jù)一致。文獻(xiàn)報道，在966，591及430 cm-1處會出現(xiàn)較明顯HA中的磷酸根中P-O的對稱伸縮振動及彎曲伸縮振動[12]，而拉曼譜圖中591及430 cm-1處對應(yīng)的磷酸根中P-O的彎曲伸縮振動幾乎消失，僅966 cm-1處出現(xiàn)微弱的P-O伸縮振動峰。這是由于拉曼光譜中散射峰的分裂現(xiàn)象不明顯，說明表面形成的HA的結(jié)晶度較低，HA的含量較少，導(dǎo)致其信號比較微弱，也與X射線衍射、紅外光譜測試結(jié)果一致。

樣品紅外光譜測試表征顯示，浸泡后，在1 025 cm-1處對應(yīng)磷酸根的峰面積均有較大程度的增加[14]，說明HA含量有一定程度的增加。此外，SBF浸泡常伴隨CO32-的取代，紅外光譜可做定性檢測，其中1 420 cm-1處出現(xiàn)了CO32-的紅外吸收峰，說明浸泡SBF后形成的HA中含有CO32-，并發(fā)生了部分取代[15]。

樣品經(jīng)過噴砂處理，在獲得多級微米形貌時，其表面與未處理表面相似(均<90°)，為親水型表面。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行納米化構(gòu)造，其初始獲得了超親水型的表面，說明在未飽和吸附有機(jī)污染物的情況下，獲得的無定型氧化鈦微納米結(jié)構(gòu)具有超親水性，在5 d吸附后呈現(xiàn)疏水狀態(tài)。經(jīng)電化學(xué)沉積HA和熱處理后，其親水性下降，說明在表面成分對親疏水性有一定的影響，但仍然呈現(xiàn)親水性狀態(tài)。

筆者通過多種表征方式證實，SLA-A-E-H組的樣品表面形成了微/納米結(jié)構(gòu)，并增加納米HA及結(jié)晶型金紅石、銳鈦礦型氧化鈦成分，有利于細(xì)胞功能的實現(xiàn)，提高生物學(xué)活性。

對樣品進(jìn)行體外活性研究，SBF浸泡后，SLA及SLA-A組表面雖然具有多級微米及微納米形貌，但礦化能力較弱，無法礦化形成HA；而SLA-A-E-H組取得顯著的效果，說明表面成分對礦化的影響較大。多級微納米結(jié)構(gòu)及納米HA的構(gòu)筑使其表面體外生物活性顯著增加，其原因有兩方面：(1)通過構(gòu)造多級微納米形貌，使得其比表面積大幅度增加，增加了單位面積上的活性位點，從而為浸泡過程中的HA的結(jié)晶形核提供了更多的位點；(2)結(jié)晶相的氧化鈦及電化學(xué)沉積的HA顆粒其本身生物活性良好，且結(jié)晶性良好，因而能為形核提供晶核，大幅縮短了表面礦化沉積部分取代HA的礦化時間。

材料表面的化學(xué)成分可以影響蛋白的吸附，從而對表面信號傳導(dǎo)，細(xì)胞粘附、生長及組織響應(yīng)有著直接的影響。涂層表面的形貌及成分對成骨細(xì)胞的貼壁情況及粘附生長狀況均有較大的影響，一定程度上反映不同處理表面的生物活性。本研究中，體外細(xì)胞培養(yǎng)也顯示出相似的結(jié)果。相比于平整的鈦表面，多級微米形貌上生長的成骨細(xì)胞能部分生長在微米孔內(nèi)或孔上，其偽足及微絨毛也能大量吸附在表面的微米結(jié)構(gòu)上，隨后通過引入納米形貌，在表面成分有一定改變的條件下，其微絨毛有較大程度的增加，原因可能是納米孔之間存在一定程度內(nèi)部貫通，更加有利于某些營養(yǎng)成分的輸送及存儲，同時納米結(jié)構(gòu)的存在也使比表面積有較大程度的提高，增加了細(xì)胞與表面的接觸面積，從而有利于成骨細(xì)胞在其表面的生長?；钚约{米HA的引入又進(jìn)一步提高了其生物相容性和活性，導(dǎo)致細(xì)胞表面微絨毛數(shù)量增加，從而增加與細(xì)胞的附著，也利于后期組織的生物礦化，形成材料與骨組織的骨性結(jié)合。

綜上所述，對鈦表面通過混合酸的噴砂酸蝕、陽極氧化可構(gòu)筑孔徑為5～8及20～30 μm多級微米孔洞及10 nm的管狀納米形貌，進(jìn)一步電化學(xué)沉積及熱處理復(fù)合寬度為30～50 nm、長度100～200 nm梭形納米HA顆粒所組成的多級微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)HA涂層，這種復(fù)合涂層體外活性高，可促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附，有望進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于鈦硬組織替代植入材料。