駱 娟， 侯 靜， 楊舒婷， 張傲來， 馬曉娜， 白 潔， 何廷美， 譚迎春， 劉明沖， 葉 平， 朱大海

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 成都 610065；2.四川臥龍國家級自然保護(hù)區(qū)管理局， 汶川 623000；3.龍溪-虹口國家級自然保護(hù)區(qū)， 都江堰 611830)

1 引 言

日本落葉松(Larixkaempferi)系松科落葉松屬高大喬木，原產(chǎn)于日本，于19世紀(jì)末作為人工造林樹種引進(jìn)至我國，由于生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)點，在遼寧、四川等14個省市廣為種植[1].隨著日本落葉松快速生長，在發(fā)揮經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值的同時，也帶來系列嚴(yán)重問題.由于日本落葉松生長迅速而造成其伴生樹種大多枯死；隨著大面積日本落葉松純林的形成，其林下植物多樣性降低，大量積累的凋落針葉層存在著火險、病蟲害等嚴(yán)重隱患[2].適當(dāng)撫育間伐，對增加日本落葉松人工林群落層次結(jié)構(gòu)，提高林下生物多樣性具有促進(jìn)作用[3].因此有必要對大量廢棄的日本落葉松枝葉展開綜合化利用的研究.

松科植物的針葉中含有多種活性物質(zhì)，如黃酮、揮發(fā)油、多糖、多酚等，具有抗氧化、降血脂、延緩衰老、抑菌及抗癌的功效[4-8].近年來，許多學(xué)者圍繞松科植物針葉的總黃酮提取和生物學(xué)活性進(jìn)行了研究.Shi等[9]通過乙醇回流法從雪松的松針中提取總黃酮并發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖.王冉等[10]利用超聲波輔助乙醇提取紅松松針中的總黃酮，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了紅松總黃酮提取工藝.司傳領(lǐng)等人[11]從日本落葉松新鮮松針95%乙醇提取物中檢測到兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素等7種化合物，并對提取物進(jìn)行了分級萃取，結(jié)果表明乙酸乙酯溶性部分抗氧化活性較強(qiáng).目前對日本落葉松凋落針葉的研究未見報道.本研究在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，超聲提取結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了日本落葉松凋落針葉的總黃酮提取工藝，并檢測提取產(chǎn)物的抗氧化活性，為進(jìn)一步綜合利用日本落葉松這一植物資源提供科學(xué)依據(jù).

2 材料與方法

2.1 材 料

40林齡日本落葉松人工林的林下凋落針葉，采自四川臥龍自然保護(hù)區(qū).對照品為蘆丁.

乙醇，正丁醇，石油醚，乙酸乙酯，維生素C等所有試劑均為分析純.

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA)；電子精密分析天平(瑞士Mettler公司，MS半微量)；純水儀(成都威思達(dá)智能公司，RM-220)；電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司，ZDHW)；多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司，SpectraMax M2)等.

2.2 實驗方法

2.2.1 總黃酮含量測定 以蘆丁為對照，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁溶液濃度為橫坐標(biāo)，得到回歸方程：y=0.9178x+0.0722(R2=0.999 3).日本落葉松凋落針葉提取物總黃酮含量用比色法測定.將20 μL濃度為1 mg/mL的樣品與30 μL 5% NaNO2混合.6 min后，加入10%AlCl3溶液50 μL.5 min后，再加入10%NaOH溶液100 μL，振蕩混勻，在25 ℃下孵育15 min.用酶標(biāo)儀在510 nm處測量吸光度.根據(jù)回歸方程計算提取液中總黃酮含量.用蘆丁當(dāng)量(RE)表示每克干物質(zhì)(dw)中的總黃酮含量，即mgRE/gdw.每個樣品做3次平行實驗.

2.2.2 單因素實驗 0.1 g日本落葉松凋落針葉粉末為樣品，以總黃酮提取量為考察指標(biāo)，分別以6個因素：乙醇濃度(40%、50%、60%、70%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 mL/g)、提取溫度(45、60、75、80、85 ℃)、提取時間(30、40、50、60 min)、超聲功率(210、240、270、300 W)、超聲頻率(20、25、40、59 kHz)進(jìn)行單因素試驗，得到各因素對凋落葉總黃酮提取量影響的實驗結(jié)果.

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計 基于單因素實驗，選取乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時間(C)3個因素為自變量，總黃酮量(Y)作為響應(yīng)值，用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行實驗設(shè)計.試驗各因素及水平見表1.

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計中的各因素及水平

2.2.4 日本落葉松凋落針葉總黃酮提取物不同萃取相制備 稱取10 g日本落葉松凋落針葉粉末于500 mL錐形瓶中，在優(yōu)化的提取條件下超聲提取2次，合并提取液，旋蒸成浸膏，加入蒸餾水200 mL重懸，重懸液依次用石油醚(沸程30～60 ℃)、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮，氮吹儀干燥后，獲得日本落葉松凋落針葉的四個萃取相：石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水余相.

2.2.5 日本落葉松凋落針葉總黃酮不同萃取相抗氧化活性比較

(1) DPPH清除能力測定[12].DPPH配成1 mmol/L的乙醇溶液，使用前用無水乙醇稀釋至0.1 mmol/L的工作濃度，不同萃取相和Vc用50%乙醇溶液配成不同濃度.96孔板加入100 μL不同濃度樣品、Vc(10～100 μg/mL)和50%乙醇，分別作為實驗組、陽性對照和空白組，加100 μLDPPH工作液，混勻室溫放置30min，酶標(biāo)儀測定517 nm處吸收值.DPPH自由基清除率(%)=(1-As/Ac)100.式中，As表示樣品或陽性對照Vc的吸收值；Ac為空白組吸收值.

(2) ABTS清除能力測定[13].磷酸鹽緩沖液PBS備用(pH 7.4，0.2 mmol/L)，以PBS為溶劑配制終濃度為7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，暗藏12～16 h生成ABTS自由基.實驗前用PBS將ABTS自由基溶液稀釋到A734為0.7±0.02，作為ABTS工作液.實驗時在96孔板中加入100 μL不同濃度的樣品和陽性對照Vc(10～100 μg/mL)和50%乙醇溶液，加入100 μL ABTS工作液，混勻，室溫放置30 min，測定734 nm處吸收值.ABTS自由基清除率(%)=(1-As/Ac)100.式中，As表示樣品或陽性對照Vc的吸收值；Ac為空白組吸收值.

(3) 總還原力測定[14].配制磷酸鹽緩沖液PBS備用(pH 6.6，0.2 mmol/L)，在96孔板中加入25 μL不同濃度樣品和陽性對照Vc(10～100 μg/mL)及50%乙醇分別作為實驗組、陽性對照和空白組.加入50 μL PBS和25 μL 1%的鐵氰化鉀水溶液，混勻后于45 ℃條件下孵育1 h，再加入50 μL 10%的三氯乙酸水溶液和60 μL 0.1%的FeCl3水溶液，混勻后測定700 nm處吸收值.A700越大表明樣品的總還原力越強(qiáng).

上述實驗重復(fù)3次.

2.2.6 數(shù)據(jù)分析 GraphPad Prism用于統(tǒng)計分析和IC50的計算，組建方差分析采用ANOVA單因素方差分析，并輔以Dunnett’st多重檢驗，P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異.

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗結(jié)果

各因素對日本落葉松凋落針葉總黃酮提取率的影響見圖1.乙醇濃度、液料比、提取時間對總黃酮的提取率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢.經(jīng)差異顯著性分析，三者對總黃酮提取率影響較大，因此選擇這三個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計.隨著溫度的提高，總黃酮提取率不斷增加(圖1c).考慮到操作的可行性、安全性和成本等，將提取溫度固定為80 ℃，超聲功率選擇270 W(圖1e)，超聲頻率定為40 kHz(圖1f).

3.2 總黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

采用Box-Behnken實驗設(shè)計方法[15]，以乙醇濃度(A)、液料比(B)和提取時間(C)為待優(yōu)化因素，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，見表2.

表2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計和實驗結(jié)果

以總黃酮含量為響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到擬合二次回歸方程：Y=136.2-3.25A+4.93B+2.11C+1.72AB+1.37AC+0.53BC-28.34A2-10.69B2-1.22C2.本模型的F值為16.8，P<0.01，具有顯著性；失擬項的P值為0.083，不顯著，說明所建模型適宜.回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9558，線性關(guān)系良好.實驗中的變異系數(shù)2.07%，實驗操作可靠，模擬方差能夠很好的模擬真實的實驗值.B、A2、B2三項的P<0.05，具有顯著性，說明液料比、乙醇濃度的平方和液料比的平方對實驗結(jié)果也有顯著影響.

(a) Ethanol concentration, (b) solvent to material ratio, (c) extraction temperature, (d) extraction time, (e) ultrasonic power, (f) ultrasonic frequency

表3 以總黃酮含量為響應(yīng)值的響應(yīng)面回歸方程方差分析

圖2是根據(jù)回歸方程，以總黃酮含量為響應(yīng)值繪出的乙醇濃度、液料比和提取時間相互影響的響應(yīng)面曲線.經(jīng)Design-Expert8.0軟件分析，得到超聲輔助提取法提取日本落葉松凋落針葉總黃酮成分的最佳條件是：乙醇濃度59.12%、液料比32.71∶1 mL/g、提取時間58.25 min，提取溫度80 ℃、超聲功率270 W、超聲頻率40 kHz，在此條件下，總黃酮含量模擬為112.911 mgRE/gdw.出于可操作性的考慮，驗證時乙醇濃度選擇60%，液料比33∶1 mL/g，提取時間58 min，其他條件與響應(yīng)面實驗條件保持一致.實驗驗證的總黃酮含量達(dá)到117.353±5.016 mgRE/gdw，兩者沒有顯著性差異(P>0.05)，符合響應(yīng)面優(yōu)化的預(yù)測值.

圖2 超聲輔助浸提法提取日本落葉松凋落針葉總黃酮的響應(yīng)曲面線

3.3 不同萃取相的總黃酮含量比較

采用優(yōu)化后的工藝提取日本落葉松凋落針葉的總黃酮，經(jīng)分級萃取后得到的各萃取相總黃酮含量見圖3.正丁醇相的總黃酮含量顯著高于其他萃取相，為736.401 3±38.585 2 mgRE/gdw.

3.4 不同萃取相的抗氧化活性比較

不同萃取相對DPPH自由基的清除能力隨著濃度增加逐漸增強(qiáng)，即抗氧化能力隨濃度增大而增強(qiáng)(圖4a).抗氧化活性從大到小依次是正丁醇相>水余相>乙酸乙酯相>石油醚相，但都弱于Vc，其IC50值分別為7.438 μg/mL、14.09 μg/mL、29.79 μg/mL、103.6 μg/mL，對照品VC的IC50值為7.259 μg/mL.

圖3 日本落葉松凋落針葉不同萃取相的總黃酮含量

不同萃取相對ABTS自由基的清除能力隨著濃度增加呈現(xiàn)上升趨勢(圖4b)，各萃取相抗氧化活性從大到小依次是正丁醇相>水余相>乙酸乙酯相>石油醚相，其IC50值分別為6.425 μg/ml、9.169 μg/mL、10.77 μg/mL、805 μg/mL.對照品VC的IC50值為8.455 μg/mL，日本落葉松凋落針葉的正丁醇萃取相表現(xiàn)出了比VC更高的清除能力.

各萃取相的總還原力均低于對照品VC，且還原力強(qiáng)弱與DPPH和ABTS清除實驗結(jié)果保持一致，正丁醇相的總還原力最強(qiáng)，其余按照總還原從大到小依次是水余相、乙酸乙酯相，石油醚相(圖4c).該結(jié)論與不同萃取相的總黃酮含量比較結(jié)果相互佐證，表明總黃酮含量與體外抗氧化活性呈正相關(guān)的關(guān)系.

4 討 論

黃酮類化合物廣泛存在于自然界中，因其存在多種藥理活性，被認(rèn)為是一類重要的天然產(chǎn)物.本文采用超聲輔助浸提法對日本落葉松凋落針葉總黃酮提取工藝進(jìn)行研究和優(yōu)化.單因素實驗中，總黃酮提取率隨提取溫度的升高不斷升高，可能與提取物中的成分有關(guān).現(xiàn)有研究表明，松針黃酮主要是由一些黃酮、黃酮苷及多聚體酚化合物前花青素組成[16].劉東彥等[17]從雪松松針中分離到大量以楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素及它們的苷類為主的黃酮類化合物.徐麗珊等人[18]優(yōu)化了濕地松松針的總黃酮提取工藝，確定的最佳提取溫度是100 ℃；皮婷婷等人[19]報道了馬尾松的最佳提取溫度是73 ℃；向福等人[20]得到大別山松針黃酮最佳提取溫度是80 ℃，說明松針黃酮存在提取溫度高的現(xiàn)象.結(jié)合不同萃取相的總黃酮含量測定結(jié)果分析，日本落葉松凋落針葉中的黃酮類物質(zhì)具有極性大、沸點高，穩(wěn)定性強(qiáng)的特點.

經(jīng)過優(yōu)化，在60%乙醇溶液、33∶1 mL/g的液料比、提取溫度80 ℃、超聲功率270 W、超聲頻率40 kHz條件下提取58 min，日本落葉松凋落針葉的總黃酮可以達(dá)到117.353±5.016 mgRE/gdw的提取量.分級萃取后，正丁醇相的總黃酮含量最高，可達(dá)到736.4013±38.5852 mgRE/gdw.總黃酮的不同萃取相中，抗氧化活性從大到小依次為正丁醇相>水余相>乙酸乙酯相>石油醚相，正丁醇相的DPPH自由基清除能力與抗壞血酸接近，ABTS自由基清除能力則優(yōu)于抗壞血酸，約是其1.3倍.本研究結(jié)果為日本落葉松凋落針葉總黃酮物質(zhì)的研究開發(fā)提供了理論依據(jù).

有研究發(fā)現(xiàn)，落葉松(Larixgmelinii)新鮮針葉總黃酮含量高于凋落針葉中的總黃酮含量，且對DPPH自由基的清除能力略高于凋落針葉[21].由于臥龍自然保護(hù)區(qū)的日本落葉松屬于大熊貓棲息地關(guān)鍵地段的人工林，不允許采伐，而且大面積栽植的日本落葉松每年產(chǎn)生的凋落葉既影響林下植物多樣性，也帶來了火災(zāi)和病蟲害隱患，因此本研究側(cè)重于日本落葉松廢棄物資源再利用的研究.研究結(jié)果表明日本落葉松凋落針葉可以作為一種潛在的抗氧化劑資源.今后將繼續(xù)開展提取物成分的分析，以確定其可能的藥理活性.