李銘銘，周 楊，冷迪雅，王 瑩，吳大明，李 謹

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料和儀器

AH-Plus(Dentsply公司，德國)；MCSNs、Ag-MCSNs、Zn-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs(Ag∶Zn=1∶1，物質(zhì)的量比)為課題組前期實驗合成并完成理化性能表征[4]； ProTaper鎳鈦器械(Dentsply公司，瑞士)；牙膠尖(Dentsply公司，瑞士)；電子天平(Sartorius公司，德國)；數(shù)顯游標卡尺(SYNTEK公司，中國)；Micro-CT(viva CT 80, SCANCO公司，瑞士)。

1.2 糊劑的理化性能測試

1.2.1 pH值測定 根據(jù)產(chǎn)品說明書制備AH-Plus糊劑，常溫靜置干燥，研磨成粉。將100 mg MCSNs、Ag-MCSNs、Zn-MCSNs、Ag-Zn-MCSNs和AH-Plus粉末分別放入含20 mL去離子水的離心管中，每組3個標本，37 ℃培養(yǎng)箱中儲存，測量1 h及1、3、5、7、14、21和28 d的溶液pH值。

1.2.3 流動性測定 按照納米粒子∶生理鹽水=2∶1 制備糊劑，將各組糊劑放入1 mL的一次性注射器中，根據(jù)ISO 6876-2012(E)推薦的方法測定其流動性(圖1)：擠壓0.05 mL糊劑至潔凈玻璃板中央，(180±5)s后加蓋一塊相同的玻璃板和100 g 砝碼，10 min后去除砝碼，測量材料鋪開的最大徑，重復(fù)測量3次取平均值，每組納入10個標本。

A：擠壓0.05 mL糊劑；B：加蓋玻璃板和砝碼；C：測量糊劑鋪開后的直徑

1.3 根管密封性能實驗

1.3.1 樣本收集與制備 在南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院外科門診收集單根恒牙，去冠，留牙根12 mm，隨機分成5個實驗組(n=30)和2個對照組(n=5)：MCSNs+牙膠尖(gutta percha, GP)組；Ag-MCSNs+GP組；Zn-MCSNs+GP組；Ag-Zn-MCSNs+GP組；AH-Plus+GP組；陽性對照組(GP)；陰性對照組(黏蠟)。

ProTaper預(yù)備根管至F3，1%次氯酸鈉沖洗，紙尖吸干。擴大針輸送糊劑至根管并充滿，常規(guī)熱牙膠充填。陽性對照組僅用GP不使用糊劑，陰性對照組根管冠方及根尖孔用黏蠟完全封閉。所有標本置于37 ℃培養(yǎng)箱儲存1周。

1.3.2 細菌滲漏測試 設(shè)計雙室細菌滲漏模型(圖2)。上室注入1%無菌亞甲基藍染料，下室注入蒸餾水，觀察至染料凝固，若下室中未出現(xiàn)藍色染料則密封性檢測通過，否則予以丟棄。無菌操作臺內(nèi)紫外燈照射過夜，上下室分別注入0.5、2.5 mL無菌腦心浸液(brain-heart infusion，BHI)培養(yǎng)基，確保根尖3 mm浸沒于BHI中。 37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。若上、下室肉湯保持透明則表明滅菌效果可靠，否則予以丟棄。

A：示意圖；B：實物圖

調(diào)節(jié)E.faecalis(ATCC 29212)菌液密度為1×108CFU/mL。上室中注入200 μL菌液浸沒根管口，下室中注入2.5 mL無菌BHI培養(yǎng)基至根尖3 mm浸沒，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察下室BHI培養(yǎng)基是否渾濁并記錄天數(shù)。觀察期為60 d，若60 d內(nèi)未出現(xiàn)渾濁，則記為未發(fā)生滲漏。使用SPSS軟件里的Kaplan-Meier繪制生存曲線。

A：MCSNs；B：Ag-MCSNs；C：Zn-MCSNs；D：Ag-Zn-MCSNs；E：AH-Plus；從左到右依次為距根尖12、8和4 mm 處橫斷面

A：ROI區(qū)域；B：圖像二元化(白色區(qū)域為充填物)

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 22.0軟件(IBM公司，美國)進行統(tǒng)計學(xué)分析，顯著性水平α=0.05。所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，Kaplan-Meier 法分析細菌滲漏結(jié)果，Log-rank檢驗和Kruskal-Wallis 檢驗比較抗?jié)B漏百分比和滲漏時間；單因素方差分析和LSD事后檢驗分析Micro-CT結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 pH值變化

5組材料28 d內(nèi)的pH變化情況見圖5。4組納米粒子溶液的pH值均呈堿性。Zn-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs的pH值較 MCSNs 和Ag-MCSNs稍低。AH-Plus的pH值在第28天時穩(wěn)定于6.2左右，呈弱酸性。

圖5 28 d內(nèi)納米粒子和AH-Plus的pH值變化曲線

2.2 溶解度與流動性

5組材料的溶解度與流動性見表1。AH-Plus溶解度最低(P<0.05)，4組納米粒子具有較低的溶解度，組間無明顯差異(P>0.05)；4組納米粒子糊劑具有良好的流動性，組間無明顯差異(P>0.05)，但均高于AH-Plus(P<0.05)。

表1 納米粒子和AH-Plus的溶解度和流動性

2.3 細菌滲漏

Ag-MCSNs組滲漏樣本最少，而MCSNs滲漏樣本則最多，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；陽性對照組全部樣本48 h內(nèi)發(fā)生滲漏，陰性對照組整個觀察期內(nèi)未出現(xiàn)滲漏(表2)。 Kaplan-Meier生存曲線圖(圖6)顯示4組MCSNs樣本滲漏主要集中于前2周，之后較為穩(wěn)定；而AH-Plus組樣本滲漏主要集中于30 d后。

表2 E. faecalis培養(yǎng)60 d后抗?jié)B漏樣本百分比和滲漏時間

M：MCSNs； AH：AH Plus

2.4 Micro-CT分析

5組樣本均顯示了較低的空隙水平(平均2.09%)，組間無顯著性差異(P>0.05)；而根管不同部位的空隙率存在差異(P<0.05)，根尖段最大，其次是根中段和根上段(表3)。

表3 根管不同分段的平均空隙百分比

3 討 論

介孔鈣硅納米材料由于良好的離子釋放特征和豐富的表面活性集團， 已成為納米材料學(xué)和納米醫(yī)學(xué)的研究熱點。本課題組前期通過模板法合成的MCSNs、Ag-MCSNs、Zn-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs均具有典型的介孔結(jié)構(gòu)，比表面積平均300 m2/g[4]，符合納米材料最適載藥比表面積要求(200～350 m2/g)。

本研究發(fā)現(xiàn)4種MCSNs溶液觀察期內(nèi)pH值穩(wěn)定于10左右，均呈強堿性，而堿性環(huán)境與材料的生物相容性、成骨潛能和抗菌性密切相關(guān)[8-10]，提示這4種MCSNs 的水溶液均具有抗菌性。溶解度和流動性是影響根管封閉劑臨床性能的重要因素。理論上根管封閉劑的溶解度應(yīng)不超過3%，根管封閉劑的流動性應(yīng)不低于17 mm[11]。本研究發(fā)現(xiàn)4種MCSNs的溶解度均不超過3%，其低溶解性有助于根管的封閉，提高根管治療的成功率。4種MCSNs糊劑也都顯示出優(yōu)于AH-Plus的流動性和可操作性，更容易滲透入根管不規(guī)則區(qū)域和牙本質(zhì)小管深處。

本研究利用細菌滲漏法評價4種MCSNs作為根管封閉劑的密封性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ag-MCSNs組滲漏樣本數(shù)最少，其次是Ag-Zn-MCSNs和AH-Plus組，這與 Antunes 等[12]和Lertmalapong 等[13]的研究結(jié)果一致。4組MCSNs的樣本滲漏主要發(fā)生于前2周，之后趨于穩(wěn)定，這可能是因為：①熱牙膠技術(shù)產(chǎn)生的熱量影響了糊劑的理化性能，導(dǎo)致其內(nèi)部不均勻和空隙的產(chǎn)生，引發(fā)短期密封性能欠佳；②納米粒子具有良好的牙本質(zhì)附著能力，Ag-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs持續(xù)釋放功能性離子(Ag+、Zn2+)[14]，能殺滅細菌或抑制其生長，阻止細菌滲漏。本研究還發(fā)現(xiàn)AH-Plus組樣本滲漏主要集中于30 d后，提示了晚期滲漏趨勢和長期密封性能欠佳，可能因為該材料不與牙本質(zhì)形成化學(xué)結(jié)合，凝固時線型的環(huán)氧樹脂分子交聯(lián)成體型，大量的加成交聯(lián)反應(yīng)可使固化后的樹脂脆性增加[15]，同時根管內(nèi)微量水分擴散至樹脂基質(zhì)中，可能使聚合物產(chǎn)生不同程度的溶解和微裂紋，繼而對長期密封性能產(chǎn)生負面影響[16]。

Micro-CT能夠可視化充填材料與牙本質(zhì)交界面多孔微觀結(jié)構(gòu)，是體外評估根管充填質(zhì)量的“金標準”[17-18]。本研究空隙分析顯示所有材料均顯示了良好的牙本質(zhì)附著性和低空隙率，這可能是因為流動性好的封閉劑、合適的牙膠尖以及熱牙膠技術(shù)使得規(guī)范預(yù)備的圓形根管形成微小空隙的均質(zhì)整體。然而，沒有材料能完全消除空隙，這與Moinzadeh等[19]和Silva等[20]研究一致，提示目前任何一種充填技術(shù)和封閉劑都無法完全消除根管內(nèi)的空隙。

4 結(jié) 論

載銀鋅MCSNs糊劑能營造長期穩(wěn)定的堿性環(huán)境，溶解度較低，流動性良好。Ag-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs作為封閉劑充填根管顯著減少了E.faecalis滲漏，根管密封性能良好。