劉艷群，李保勝，李雨陽，劉玉潔，王昊陽，張震陽，孟維艷

種植義齒已逐漸成為牙列缺損或牙列缺失首選的修復(fù)方式[1]，但與天然牙相比，種植體周圍的上皮封閉效果欠佳，導(dǎo)致細菌更容易突破上皮屏障，引起深層結(jié)締組織甚至骨組織的炎癥，引發(fā)種植體周圍炎。在種植體周圍炎的發(fā)病過程中，駐留在牙周組織中的巨噬細胞受到病原菌等致病因素的刺激可發(fā)生明顯的表型和功能變化[2]。目前，牙齦卟啉單胞菌(Poryromonasgingivlis，P.g)被公認為是引起種植體周圍炎的主要病原體之一[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是P.g細胞外壁的主要成分，主要由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成，是P.g的主要毒力因子。巨噬細胞在P.g-LPS刺激下，向促炎巨噬細胞表型(M1型)轉(zhuǎn)化，通過細胞膜表面Toll樣受體4(TLR4)識別LPS，激活核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路傳導(dǎo)信號，分泌炎性介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)等募集更多炎癥細胞聚集，并促進破骨細胞分化，引起種植體周圍軟硬組織的破壞[4]。因此巨噬細胞在種植體周圍炎的病理發(fā)生過程中充當(dāng)重要角色，通過減少巨噬細胞向促炎表型極化，抑制炎癥反應(yīng)有望成為治療種植體周圍炎的重要靶點。

ω-3多不飽和脂肪酸是從深海魚類、海藻中提取出來的天然物質(zhì)，研究表明其具有抗炎、抗菌、抗腫瘤的作用[5]，被應(yīng)用于腸炎等菌群失調(diào)疾病，此外還能夠改善糖尿病患者的代謝水平[6]。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)是一種人體內(nèi)無法通過自身合成的ω-3多不飽和脂肪酸，研究表明DHA可以縮短糖尿病患者的傷口愈合時間，減少傷口處促炎型(M1型)巨噬細胞的浸潤[7]。此外DHA可以通過減少LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞TNF-α的產(chǎn)生進而抑制破骨細胞的生成,發(fā)揮骨保護作用[8]。然而，DHA能否影響P.g-LPS引起的巨噬細胞炎癥反應(yīng)以及其對種植體周圍炎的作用罕見報道。因此，我們以巨噬細胞模型RAW264.7為研究對象，探究DHA對P.g-LPS誘發(fā)巨噬細胞炎癥的調(diào)控作用，為DHA治療種植體周圍炎提供前期研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

DHA(純度≥98%，編號1704081)(阿拉丁，中國)；小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞(上海中科院細胞所，中國)；HDMEM培養(yǎng)基、PBS、青/鏈霉素、0.25%胰酶(Hyclone，美國)；P.g-LPS(InvivoGen，美國)；CCK-8試劑盒(碧云天，中國)；ELISA試劑盒(R&D，美國)；細胞RNA提取試劑盒(博麥德，中國)；PrimescriptTMTaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimerScriptTMRT-PCR Kit(Takara，日本)；qRT-PCR擴增儀MX3005P(Agilent，美國)；熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(SANYO，日本)；二甲基亞砜DMSO(北京化工廠，中國)；活性氧檢測試劑盒(萬類生物，中國)。

1.2 DHA的配制

DHA溶解在DMSO中制成100 mmol/L的原液，用培養(yǎng)基稀釋至最終濃度100 μmol/L，確保最終用于后續(xù)免疫活性測定實驗的溶液DMSO的含量小于0.1%。

1.3 細胞培養(yǎng)

取-80 ℃凍存的RAW264.7細胞，立即置于37 ℃快速溶解，之后將含有RAW264.7細胞的凍存液轉(zhuǎn)移到10 mL HDMEM中，1 500 r/min、3 min離心后棄上清，用2 mL含有10%胎牛血清的HDMEM重懸細胞，接種在2個25 mm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，取對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 細胞毒性實驗

將3×103個RAW264.7細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后設(shè)置對照組(HDMEM培養(yǎng)基)、P.g-LPS組(1 mg/L)、P.g-LPS+DHA組(25、50、75、100 μmol/L)，每組設(shè)3個復(fù)孔。對照組細胞正常培養(yǎng)24 h，然后換液繼續(xù)用HEDME培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；P.g-LPS組用1 mg/LP.g-LPS預(yù)處理24 h，然后用HDEME培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；實驗組分別用終濃度為1 mg/LP.g-LPS預(yù)處理24 h，然后分別加入含25、50、75、100 μmol/L 的DHA培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL HDMEM和10 μL CCK-8試劑孵育2 h，450 nm波長處測定吸光度(D)。

1.5 實驗分組

在六孔板中以2×105個/孔的細胞密度接種RAW264.7，根據(jù)上述細胞毒性實驗結(jié)果設(shè)為5組：對照組(HDMEM培養(yǎng)基)，P.g-LPS組(1 mg/L的LPS可以活化巨噬細胞[9-10])，以及P.g-LPS+DHA組(25、50、75 μmol/L)3個實驗組，每組3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.6 實時熒光逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(qRT-PCR)檢測

用RNA快速提取試劑盒提取RNA，于Nano Drop2000分光光度計上檢測RNA濃度，按照PrimescriptTMTaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，按照SYBR PrimerScriptTMRT-PCR Kit說明書聯(lián)合熒光定量PCR儀進行擴增和檢測，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)總體系為20 μL，cDNA模板2 μL，無酶水4 μL，上下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green Master RT-PCR ROXmix1 3 μL。引物見表1，每次擴增以 β-Actin基因為內(nèi)參，采用相對定量法2-ΔΔct對PCR產(chǎn)物進行分析，比較各組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達。

表1 引物序列及擴增長度

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測

提取各組細胞上清液，在超速離心機中以2×105r/min離心20 min，按ELISA試劑盒操作步驟分別檢測炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌量，在酶標(biāo)儀波長為450 nm和570 nm的情況下檢測其吸光度，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的生成濃度。

1.8 DCFH-DA檢測活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生

在六孔板中以2×105個/孔的細胞密度接種RAW264.7，待細胞貼壁后生長至密度為70%時進行加藥處理。對照組細胞正常培養(yǎng)24 h，然后換液繼續(xù)用HEDME培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；P.g-LPS組用1 mg/LP.g-LPS預(yù)處理24 h，然后用HDEME培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；實驗組分別用終濃度為1 mg/LP.g-LPS預(yù)處理24 h，然后分別加入含25、50、75 μmol/L 的DHA培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h將各組細胞上清液棄去，加入PBS清洗2次。分別加入1 mL的DCFH-DA稀釋液(按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)基稀釋)混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔3 min顛倒混勻。用PBS洗細胞3次，充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，熒光顯微鏡下觀察細胞。然后用Image J軟件進行圖像分析，獲得熒光強度總和。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 DHA對P.g-LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞的毒性作用

①與對照組相比，1 mg/L的P.g-LPS可引起巨噬細胞的增殖，細胞活性增強，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。②100 μmol/L的DHA明顯抑制P.g-LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞的增殖活性(P<0.05)。③≤75 μmol/L的DHA不影響P.g-LPS誘導(dǎo)過的RAW264.7的增殖活性(P>0.05)(圖1)。

A：對照組(HDMEM培養(yǎng)基)；B：P.g-LPS組(1mg/L)；C：P.g-LPS+25 μmol/LDHA組；D：P.g-LPS+50 μmol/L DHA組；E：P.g-LPS+75 μmol/L DHA組；F：P.g-LPS+100 μmol/L DHA組；與P.g-LPS組相比，****：P<0.000 1

2.2 25、50、75 μmol/L DHA對P.g-LPS刺激下RAW264.7細胞內(nèi)炎性因子mRNA表達的影響

5組炎性因子mRNA表達結(jié)果如下：①1 mg/L的P.g- LPS刺激RAW264.7細胞，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達均顯著增高(P<0.05)，證明P.g-LPS誘導(dǎo)體外炎癥模型成功；②75 μmol/L DHA明顯抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(P<0.05)；③25、50 μmol/L DHA均顯著抑制TNF-α、IL-6 mRNA的表達(P<0.05)，但25、50 μmol/L DHA對IL-1β mRNA的表達均無顯著影響(圖2)。

A：對照組(HDMEM培養(yǎng)基)；B：P.g-LPS組(1mg/L)；C：P.g-LPS+25 μmol/L DHA組；D：P.g-LPS+50 μmol/L DHA組；E：P.g-LPS+75 μmol/L DHA組；與P.g-LPS組相比，**：P<0.01，***：P<0.001， ****：P<0.000 1

2.3 25、50、75 μmol/L DHA對P.g-LPS刺激下RAW264.7炎性因子相關(guān)蛋白分泌的影響

5組RAW264.7炎性因子相關(guān)蛋白分泌結(jié)果如下：①1 mg/L的P.g-LPS刺激RAW264.7細胞后，細胞上清液中TNF-α、IL-6的表達均顯著增高(P<0.05)；②25、50、75 μmol/L DHA均明顯抑制TNF-α、IL-6的分泌(P<0.05)；③各組均未測得IL-1β的分泌(圖3)。

A：對照組(HDMEM培養(yǎng)基)；B：P.g-LPS組(1mg/L)；C：P.g-LPS+25 μmol/L DHA組；D：P.g-LPS+50 μmol/L DHA組；E：P.g-LPS+75 μmol/L DHA組；與P.g-LPS組相比，****：P<0.0001

2.4 25、50、75 μmol/L DHA對P.g-LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞ROS的影響

ROS檢測結(jié)果如下：在免疫熒光顯微鏡下，5組均出現(xiàn)綠色熒光，且各組熒光強度有明顯差異。①對照組僅有少量綠色熒光(圖4A)；②1 mg/LP.g-LPS刺激后RAW256.7細胞內(nèi)綠色熒光強度明顯增加(圖4B)；③25、50、75 μmol/L DHA組綠色熒光強度減弱，且濃度越高減弱程度越強(圖4C、D、E)。④用ImageJ分析各組熒光強度，結(jié)果顯示P.g-LPS組熒光強度明顯增強(P<0.05)，不同DHA組較P.g-LPS組熒光強度明顯減弱，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且減弱程度與DHA濃度呈正相關(guān)(P<0.05)(圖4F)。

A：對照組；B：P.g-LPS組；C：P.g-LPS+25 μmol/L DHA；D：P.g-LPS +50 μmol/L DHA；E:P.g-LPS +75 μmol/L DHA；F；探針熒光強度與P.g-LPS組相比，****：P<0.0001； DHA組間對比，#：P<0.01

3 討 論

種植體周圍組織的健康與巨噬細胞密切相關(guān)，巨噬細胞可以分泌炎癥因子改變種植體周圍的局部微環(huán)境，一方面清除外來病原體和細胞碎片，另一方面促進局部炎癥細胞浸潤，損傷種植體周圍的軟硬組織[4]。因此本實驗用種植體主要致病菌P.g的胞外LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥模擬種植體周圍的炎癥環(huán)境，探究DHA的炎癥抑制作用，以期待從限制種植體周圍巨噬細胞炎癥反應(yīng)的新視角為種植體周圍炎的防治提供新的方案。

目前DHA是公認存在于腦細胞膜的一種抗炎活性分子，其主要通過直接或間接作用于小膠質(zhì)細胞減少促炎因子的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用[11-12]。DHA這種抗炎潛力為其在炎癥性疾病的治療應(yīng)用中開拓了廣泛前景。Meital等[13]發(fā)現(xiàn)DHA可以減少LPS誘導(dǎo)的腹主動脈瘤患者提取的巨噬細胞促炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達以及ROS的產(chǎn)生。此外通過系統(tǒng)性補充ω-3多不飽和脂肪酸(富含DHA)可以減輕牙周炎患者探診深度，對牙周傷口的愈合具有積極作用[14]。因此探究DHA對P.g-LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥的抑制作用對后期DHA在牙周炎以及種植體周圍炎的應(yīng)用具有重要意義。

DHA對細胞的毒性作用具有選擇性，研究表明100 μmol/L的DHA促進骨髓瘤患者外周血提取的單核細胞凋亡，但對從健康人獲取的單核細胞沒有不良反應(yīng)[15]。本研究通過細胞活力檢測發(fā)現(xiàn)≤75 μmol/L的DHA作用濃度不影響P.g-LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞的增殖活性，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。100 μmol/L的DHA明顯抑制P.g-LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞的增殖(P<0.05)， 該濃度下的DHA作用濃度可能由于其抑制了P.g-LPS誘導(dǎo)過的巨噬細胞的增殖而發(fā)揮抗炎作用。為了排除DHA的細胞毒性作用對促炎細胞因子分泌的影響，因此我們呈濃度梯度選擇25、50、75 μmol/L的DHA安全作用濃度用于后續(xù)實驗。

種植體周圍炎發(fā)生時其周圍組織中巨噬細胞的比例明顯增高，巨噬細胞是急性期免疫反應(yīng)的應(yīng)答者，釋放促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6[4]，這些炎性細胞因子又可以作為前體物質(zhì)誘發(fā)后續(xù)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)[16]，通過信號傳導(dǎo)減少成骨細胞而增加破骨細胞的分化趨向，進而導(dǎo)致種植體周圍的骨質(zhì)流失[17]。研究發(fā)現(xiàn)種植周圍炎部位的牙齦組織和齦溝液中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達較健康部位增高[18]，這與我們構(gòu)建的體外炎癥模型一致。在P.g-LPS對巨噬細胞無明顯的毒性和無促增殖作用條件下，用1 mg/L的P.g- LPS刺激巨噬細胞后，炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達均明顯增高，細胞上清液中TNF-α、IL-6蛋白分泌明顯增加，說明P.g-LPS活化巨噬細胞成功，與先前的LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥反應(yīng)一致[9-10]。而25～75 μmol/L DHA可顯著抑制上述炎癥因子的表達，說明DHA可以通過在mRNA水平上抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表達以及在蛋白水平上抑制TNF-α和IL-6分泌，從而減輕巨噬細胞的過度炎癥反應(yīng)引起的組織損傷。但是在各組細胞上清液中均未檢測到IL-1β的分泌，我們分析其中原因可能與以下幾個方面有關(guān)：①巨噬細胞分泌IL-1β需要LPS的啟動，小鼠比人的巨噬細胞中LPS的刺激作用更明顯[19]，所以可以檢測到IL-1β mRNA的表達，但IL-1β的分泌需要更多的信號(ATP、牙齦蛋白酶)參與[20]，因此在僅存在P.g-LPS的條件下，IL-1β不能正常分泌。②IL-1β缺乏自發(fā)分泌的信號序列而需要通過一系列的信號通路完成，P.g-LPS誘導(dǎo)巨噬細胞表達前體IL-1β mRNA，前體IL-1β必須要經(jīng)過NLRP3炎性小體的修飾才能加工為成熟的IL-1β，進而釋放至胞外[21-22]，而RAW264.7細胞缺乏組裝NLRP3炎性小體的適配器ASC[23]，ASC的缺乏導(dǎo)致前體IL-1β無法轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β，從而無法分泌到細胞上清液中。Wierenga等[24]在LPS刺激RAW264.7細胞后也未檢測到IL-1β的分泌，與本實驗結(jié)果一致。

細菌及其毒力因子透過上皮屏障后與巨噬細胞的TLR4結(jié)合，可以誘發(fā)細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，ROS作為細胞內(nèi)的第二信使，與炎癥級聯(lián)反應(yīng)存在偶聯(lián)，加劇炎癥反應(yīng)，當(dāng)ROS大量聚積時，可引起細胞DNA片段化、細胞壞死裂解，增加炎性細胞因子的分泌和炎癥的放大，從而加重細胞和組織損傷[25-26]。因此細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生可以間接反映炎癥反應(yīng)程度，本研究發(fā)現(xiàn)DHA呈濃度依賴性抑制巨噬細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，分析其可能與DHA含有多個雙鍵，能有效還原活性氧的氧化態(tài)有關(guān)。因此，DHA抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表達的機制可能也與其抑制細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生有關(guān)，但具體機制仍需進一步探究。

綜上所述，高濃度的DHA可以抑制P.g-LPS活化的巨噬細胞的增殖，安全范圍內(nèi)的DHA可以減少P.g-LPS誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，減少炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達和TNF-α、IL-6的分泌，發(fā)揮抗炎抗氧化作用，為后期探索DHA在種植體周圍炎防治方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。