朱 珠，張 瑋

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的骨骼疾病，常發(fā)生于老年人、絕經(jīng)后或雌激素缺乏的婦女，其主要特點是骨重建率高，骨吸收率高于骨形成率[1]。骨質(zhì)疏松癥增加了骨折的風(fēng)險，并可能導(dǎo)致高昂的醫(yī)療費(fèi)用，該病的防治越來越受到重視。目前對這種疾病的治療主要是藥物治療，如降鈣素、雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑和人單克隆抗體[2-5]。然而，這些藥物的使用增加了頜骨骨壞死、中風(fēng)和癌癥的風(fēng)險[6-7]。因此，有必要尋找更安全、更有效的抗骨質(zhì)疏松藥物。

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞，具有分化成各種組織的潛能，如成骨細(xì)胞，通常從骨髓和骨外間充質(zhì)中分離出來。小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)就是其中一種，因其在體內(nèi)分布廣泛、易于獲得而常被用作研究骨外間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的模型細(xì)胞系[8-9]。

從植物中提取的天然化合物是潛在的抗骨質(zhì)疏松藥物的資源。川續(xù)斷是多年生草本續(xù)斷的干根，生長在我國濕潤的田野和山區(qū)，是我國長期安全使用的補(bǔ)腎中藥，用于治療骨折和關(guān)節(jié)疾病[10]。川續(xù)斷皂苷Ⅵ(Asperosaponin Ⅵ，ASA Ⅵ)是川續(xù)斷最主要的生物活性成分，具有多種有益的特性，包括神經(jīng)保護(hù)、預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防心肌梗死、抗凋亡和鎮(zhèn)痛等[11-13]。然而，到目前為止，還沒有關(guān)于ASA Ⅵ對C2C12細(xì)胞成骨作用的報道，因此本研究試圖采用C2C12細(xì)胞作為研究模型來探討ASA Ⅵ對其的作用及影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

ASAⅥ(純度>99%，中國藥品生物制品檢定所)溶解在二甲基亞砜溶液(DMSO)中，并在-20 ℃下儲存。DMEM培養(yǎng)基，抗壞血酸磷酸酯、β-甘油磷酸酯、地塞米松和茜素紅(Sigma公司，美國)，胎牛血清(FBS)(Invigentech，美國)，Trizol試劑(諾唯贊生物科技有限公司，南京)，細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)(新賽美公司，蘇州)，ALP活性試劑盒(建成，南京)，BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(碧云天，上海)，PVDF膜(Millipore，德國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和成骨分化 C2C12細(xì)胞購自美國菌種保藏中心(ATCC，美國)。細(xì)胞在含有10% FBS和1%青霉素和鏈霉素(碧云天，上海)的DMEM中培養(yǎng)，放入5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱孵育。成骨培養(yǎng)基(1 mmol/L地塞米松、1 mol/L β-甘油磷酸和10 mmol/L L-抗壞血酸)誘導(dǎo)成骨分化。

1.2.2 細(xì)胞活力測定 細(xì)胞接種在96孔板中，密度為1×103個細(xì)胞/孔。每孔含100 μL培養(yǎng)基，37 ℃孵育。24 h后，用不同劑量的ASA Ⅵ(0、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L)處理細(xì)胞，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，對照組用DMSO處理。培養(yǎng)1、2、3 d后，使用CCK-8測定細(xì)胞活力。在450 nm處用分孔分光光度計測定吸光度。每次實驗均重復(fù)3次。

1.2.3 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測定 將細(xì)胞與不同濃度的ASA Ⅵ(0、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L)一起接種在24孔板(2×103個細(xì)胞/孔)中，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。在成骨誘導(dǎo)4 d或7 d后，用0.2%Triton X-100(碧云天，上海)在冰上裂解細(xì)胞，然后在4 ℃條件下，以14 000 r/min離心15 min。收集上清液，使用ALP活性試劑盒檢測ALP活性，并使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度，篩選出促進(jìn)C2C12細(xì)胞成骨分化的最佳作用濃度。

1.2.4 茜素紅染色 將細(xì)胞接種在含有或不含ASA Ⅵ(促ALP活性的最佳作用濃度)的成骨培養(yǎng)基中，每3 d換1次培養(yǎng)基。到第7天時，細(xì)胞用PBS洗滌兩次，用98%乙醇固定20 min。然后，再次用PBS洗滌，每孔加入適量茜素紅溶液，37 ℃孵育15 min，鏡下拍攝鈣結(jié)節(jié)。

1.2.5 實時定量PCR檢測 采用實時PCR檢測顯著的成骨分化相關(guān)標(biāo)記基因，包括堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(Ocn)、1型膠原α1(Col1α1)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的表達(dá)水平。將細(xì)胞接種于6孔板(4×104個細(xì)胞/孔)和ASA Ⅵ(促ALP活性的最佳作用濃度)的成骨培養(yǎng)基中，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。在成骨誘導(dǎo)7 d后，使用Trizol試劑提取總RNA，對ALP、Ocn、Col1α1和Runx2進(jìn)行cDNA合成。β-actin作為內(nèi)參。

1.2.6 免疫印跡分析 如前所述，成骨誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)7 d后，用PBS洗滌3次，用RIPA緩沖液(碧云天，上海)在冰上裂解，然后在12 000 r/min離心5 min。收集上清液，并使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度；50 μg蛋白質(zhì)煮沸10 min，通過SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在TBST緩沖液中用5%BSA封閉膜，在4 ℃下與一級抗體孵育過夜。在TBST中洗滌膜3次15 min，并在室溫下與二級抗體孵育30 min。用曝光機(jī)測定實驗帶的吸光度值與β-actin吸光度的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計與方法

所有實驗均至少重復(fù)3次，用單因素方差分析比較各組間的差異。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ASA Ⅵ對C2C12細(xì)胞增殖的影響

ASAⅥ誘導(dǎo)1、2和3 d后，1×10-3、1×10-4mol/L組明顯抑制細(xì)胞增殖，對細(xì)胞有一定的毒性(P<0.01)，而1×10-8～1×10-5mol/L組則對細(xì)胞增殖均無明顯作用(P>0.05)(圖1)。

**：P<0.01

2.2 ASA Ⅵ對C2C12細(xì)胞ALP活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)1×10-8～1×10-5mol/L均能促進(jìn)細(xì)胞分化，但其中1×10-6mol/L促進(jìn)細(xì)胞分化的效果最為明顯(P<0.01)(圖2)。因此后續(xù)以1×10-6mol/L為最佳促分化濃度進(jìn)行實驗。

*：P<0.05；**：P<0.01

2.3 ASA Ⅵ對C2C12細(xì)胞礦化的影響

采用茜素紅染色法檢測了ASA Ⅵ對C2C12細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)沉積的影響(圖3)。與對照組相比，1×10-6mol/L組中紅色標(biāo)記的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量顯著增加(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，ASA Ⅵ增強(qiáng)了C2C12細(xì)胞的鈣沉積。

A：對照組細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)沉積(肉眼觀)；B：1×10-6 mol/L ASA Ⅵ組細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)沉積(肉眼觀)；C：對照組細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)沉積(茜素紅染色 ×10)；D：1×10-6 mol/L ASA Ⅵ組細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)沉積(茜素紅染色 ×10)

2.4 ASA Ⅵ對C2C12細(xì)胞成骨分化的影響

我們在mRNA和蛋白質(zhì)水平分別檢測了幾個成骨指標(biāo)(ALP、Runx2、Ocn和Col1α1)的表達(dá)水平。與對照組相比，ASA Ⅵ組的ALP、Runx2、Ocn和Col1α1的表達(dá)量均升高(圖4，P<0.05)。這些結(jié)果表明，ASA Ⅵ促進(jìn)了C2C12細(xì)胞的成骨分化。

A：PCR結(jié)果，*：與對照組相比，P<0.05；**：與對照組相比，P<0.01；B：Western blot結(jié)果

3 討 論

隨著年齡的增長，老年人身體機(jī)能逐漸退化，其體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量及成骨分化能力也降低，骨形成顯著減少，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[14]。有文獻(xiàn)表明，骨外間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下，可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞并發(fā)揮功能[15]，并且骨外間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量巨大，取材容易，創(chuàng)傷較小，體外培養(yǎng)傳代增殖能力較強(qiáng)。其引起了組織工程領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，提供了一條新的成骨細(xì)胞的來源。

C2C12細(xì)胞是小鼠成肌細(xì)胞，起源于未分化的骨外間充質(zhì)細(xì)胞，可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。有研究表明，成纖維細(xì)胞生長因子21能促進(jìn)C2C12的成骨分化，表明C2C12有向成骨細(xì)胞分化的潛能[16]。在我們的研究中，我們通過茜素紅染色分析發(fā)現(xiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)，這表明C2C12具有向成骨細(xì)胞分化的能力，為我們的研究提供了良好的模型。

ASAⅥ是傳統(tǒng)中藥川續(xù)斷的主要活性成分之一[17]，藥理作用廣泛。有文獻(xiàn)報道，ASA Ⅵ有較強(qiáng)的抗炎作用，并可用于開發(fā)治療疼痛和炎癥相關(guān)疾病的藥物[18]；ASA Ⅵ還通過抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號通路，來抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生，可能是一種潛在的動脈粥樣硬化防治藥物[19]；也有研究發(fā)現(xiàn)，ASA Ⅵ對神經(jīng)元細(xì)胞PC12細(xì)胞中淀粉樣β誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有神經(jīng)保護(hù)作用[20]，而且ASA Ⅵ不僅可以改善阿爾茨海默癥相關(guān)的炎癥，還可以改善記憶障礙[21]；此外，ASA Ⅵ抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的磷酸化，暗示這一途徑可能與ASA Ⅵ的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制有關(guān)[22]。這些研究都表明ASA Ⅵ有較高的研究和開發(fā)價值。

在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，ASA Ⅵ常被用來治療腎臟和骨骼疾病。此前，有文獻(xiàn)報道，ASA Ⅵ可以通過抑制破骨細(xì)胞的形成，減輕骨質(zhì)疏松引起的關(guān)節(jié)炎[23]。也有研究表明，ASA Ⅵ可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，提高成骨細(xì)胞的活性和數(shù)量，促進(jìn)基質(zhì)鈣化、骨痂生長，從而防止骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折的愈合[24]。綜上所述，ASA Ⅵ既能增加骨形成，同時也能抑制骨吸收。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了高濃度的ASA Ⅵ(如1×10-3、1×10-4mol/L)對C2C12有明顯的毒性作用，而低濃度的ASA Ⅵ對C2C12細(xì)胞增殖影響較小，但其卻增強(qiáng)了C2C12的ALP活性，其中效果最佳的濃度是1×10-6mol/L。由于C2C12細(xì)胞生長速度較快，盡管我們降低了96孔板的細(xì)胞接種密度，但在4～5 d時，細(xì)胞仍舊鋪滿整個孔板，且有部分細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡，所以我們選取了1、2、3 d這幾個時間點來觀察ASA Ⅵ對C2C12細(xì)胞增殖的影響。此外，ASA Ⅵ還上調(diào)了C2C12中Ocn、Runx2和Col1α1的mRNA和蛋白質(zhì)水平。綜上所述，我們得出結(jié)論，ASA Ⅵ通過誘導(dǎo)ALP、Ocn、Runx2和Col1α1等骨相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)C2C12的成骨分化。

PCR結(jié)果顯示，Ocn是其中明顯增長的成骨指標(biāo)之一。Ocn是成骨細(xì)胞分化和骨形成最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一[25]。正常生理情況下，Ocn特異地與羥磷灰石結(jié)合，使骨鹽沉積形成羥磷灰石結(jié)晶，調(diào)整骨礦化沉積速率，調(diào)節(jié)骨的生長，Ocn促進(jìn)非結(jié)晶的鈣磷鹽向羥磷灰石轉(zhuǎn)變，調(diào)整結(jié)晶在膠原上的分布、走向，進(jìn)而增加骨鹽含量提高骨強(qiáng)度，是成骨細(xì)胞的唯一特異性生化指標(biāo)[26]。本實驗結(jié)果顯示1×10-6mol/L ASA Ⅵ作用7 d后，Ocn的表達(dá)增加，說明1×10-6mol/L ASA Ⅵ能促進(jìn)C2C12細(xì)胞成骨分化。

目前已有學(xué)者證實ASA Ⅵ可以通過PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化[13]；還可以通過BMP-2/MAPK/SMAD依賴的Runx2信號通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[27]。這些結(jié)果表明，一種藥物可以通過多種信號通路協(xié)同作用。但是ASA Ⅵ到底是通過何種信號通路促進(jìn)C2C12成骨分化還未知，仍需后續(xù)研究證實。

雖然關(guān)于C2C12的潛能和ASA Ⅵ對成骨細(xì)胞的作用分別有報道，但ASA Ⅵ對C2C12分化的影響卻鮮有報道。本研究將ASA Ⅵ和C2C12結(jié)合起來，發(fā)現(xiàn)ASA Ⅵ的加入顯著促進(jìn)了C2C12的成骨分化，也為治療骨質(zhì)疏松癥提供了一個新的視角。