趙維榮，趙銘昕，徐 婧，張丹瑋，郭藝迪，關(guān)振宏，段 銘，張茂林

（1.吉林大學(xué)人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062；2.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

【研究意義】狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一種古老的、以神經(jīng)系統(tǒng)感染為特征的人獸共患病毒性傳染?。?］。該病一直是公共衛(wèi)生關(guān)注的重點，感染者一旦發(fā)病，死亡率可近乎達到100%［2］，迄今為止尚無有效的治療方法。目前該病主要流行于亞洲和非洲，其中印度和中國較為嚴重［3］。RABV 典型的病毒粒子呈子彈狀，基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，大小約12 kb，沿3′端向5′端依次編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和依賴RNA 的RNA 聚合酶蛋白（L）。基因組RNA 與N、P、L 蛋白共同形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP），也稱核衣殼，是病毒轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制的功能性模板［4-6］。M 蛋白位于RABV囊膜下，連接RNP 和保護性抗原G，在RNP 和含糖蛋白囊膜之間起橋梁作用［7］。了解M 蛋白的合成分布場所有利于解析RABV 病毒粒子的裝配過程。

【前人研究進展】M 蛋白由202 個氨基酸組成，是RABV 結(jié)構(gòu)蛋白中長度最小的一種蛋白。已有研究表明，M 蛋白在細胞膜上的聚集可以增加其對脂質(zhì)雙分子層的結(jié)合親和力，在膜曲率、RNPs 包膜和病毒出芽中發(fā)揮重要作用，并且在調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白合成及裝配的動態(tài)平衡中也起重要作用，同時對于RABV 致病性及子代病毒粒子的形態(tài)發(fā)生也至關(guān)重要［8-9］。在RABV 5 個結(jié)構(gòu)蛋白中，N 蛋白、P 蛋白和L 蛋白主要在胞質(zhì)內(nèi)基氏小體中合成，G 蛋白主要通過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）翻譯和高爾基體（Golgi）加工，最后到達出芽部位［10-11］。對于M 蛋白的研究更多集中在其作用上，而對于其合成和分布場所的研究則相對較少。

【本研究切入點】研究M 蛋白合成和分布場所是揭示RABV 病毒粒子轉(zhuǎn)配過程中M 蛋白、G 蛋白和RNP 三者間結(jié)合順序的關(guān)鍵?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究首先利用TCID50法對3 種RABV 毒株（CVS-11、SRV-9、PB4）在N2A、BHK 細胞上的效價進行測定，隨后分別接種N2A、BHK 細胞，利用免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡觀察RABV M 蛋白與ER 和Golgi 在胞內(nèi)共定位以及M 蛋白與G 蛋白、M 蛋白與N 蛋白在這兩種細胞器內(nèi)的共定位，研究結(jié)果可望推斷M蛋白的合成加工途徑以及G 蛋白、M 蛋白和RNP三者的組裝順序，為RABV 粒子的復(fù)制與裝配過程的解析提供有力證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞與毒株 小鼠神經(jīng)瘤母細胞N2A、乳倉鼠腎細胞BHK 由吉林大學(xué)人獸共患病研究所病毒病研究室保存并進行傳代培養(yǎng)。RABV 的實驗室標準攻擊毒株CVS-11、口服疫苗毒株SRV-9由吉林大學(xué)人獸共患病研究所病毒病研究室保存，街毒株P(guān)B4 由長春軍事獸醫(yī)研究所OIE 狂犬病參考實驗室涂長春研究員惠贈。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 細胞培養(yǎng)基DMEM、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志蛋白抗體〔Anti-Calnexin antibody produced in rabbit，Anti-Protein Disulfide Isomerase（MD-12）antibody produced in rabbit〕和高爾基體標志蛋白抗體（Anti-ERGIC-53/p58 antibody produced in rabbit）購自Sigma 公司；胎牛血清FBS 購自Biological Industries 公司，青鏈霉素混合液、Hoechs 33258 染色液購自Solarbio 公司；丙酮購自北京化工廠；PBS 粉末試劑購自Monad公司；伊文思蘭、Alexa FluorTM546 goat antirabbit antibody、Alexa FluorTM647 goat anti-mouse antibody 購自Thermo 公司；多聚甲醛溶液購自源葉生物公司；Triton X-100 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin 購自FUJIREBIO 公司；FITC Anti-RABV G 蛋白抗體、FITC Anti-RABV P 蛋白抗體由長春軍事獸醫(yī)研究所扈榮良研究員惠贈；鼠源抗RABV M 蛋白抗體由吉林大學(xué)人獸共患病研究所病毒病研究室制作并保存。96 孔板、24 孔板購自Corning 公司；細胞爬片購自NEST 公司；顯微鏡蓋玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒培養(yǎng) 用T25 細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)BHK 細胞至70%～80%時，按MOI=1 的量將CVS-11、SRV-9 接種于細胞瓶中，37℃下感作1 h 后棄去上清，加入含1% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，96 h 后置于-80℃并反復(fù)凍融3 次，4℃、1 000 r/min 離心10 min 取上清，分裝保存于-80℃。PB4 由4 周齡小鼠顱內(nèi)接種培養(yǎng)，待小鼠瀕死時無菌取鼠腦，加入含20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，組織細胞破碎儀充分破碎研磨后，4℃、1 000 r/min 離心10 min 取上清，分裝保存于-80℃。

1.2.2 TCID50法測定不同RABV 毒株效價 取96 孔板，將細胞以1×104個/孔鋪于孔板中，37℃培養(yǎng)12 h 待其貼壁后棄去上清，將病毒液用含1%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基按10-1～10-8倍比稀釋，4 個復(fù)孔，100 μL/孔。37℃培養(yǎng)48 h 后棄去上清，PBS 潤洗1 次，在80%冷丙酮中室溫下固定30 min，PBS 潤洗3 次，將FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin、伊文思藍均以1∶200 稀釋，每孔加入50 μL，37℃避光孵育1 h，PBS 清洗3 次，每次10 min，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光標記的陽性孔數(shù)并記錄，應(yīng)用Spearman-Karber 公式計算每種RABV 毒株的TCID50。

1.2.3 免疫熒光 將細胞爬片放進24 孔板，將細胞以10×104/孔鋪于爬片上，37℃培養(yǎng)12 h 待其貼壁后棄去上清，PBS 潤洗3 次，加入少量不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基，將CVS-11、SRV-9、PB4按MOI=1 進行接毒并設(shè)置對照，置37℃感作1 h后棄去上清，PBS 潤洗3 次，加入含1% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，CVS-11、SRV-9 于培養(yǎng)24 h 時收樣，PB4 于培養(yǎng)72 h 時收樣；4% PFA室溫固定25～30 min，0.1% Triton-X 100 室溫打孔10 min，10% FBS 室溫封閉2 h，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體標志蛋白抗體作為一抗4℃過夜，其熒光二抗、抗RABV M 蛋白抗體及其熒光二抗、FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin、FITC Anti-RABV G 蛋白抗體、FITC Anti-RABV P 蛋白抗體均于37℃孵育1 h 即可，Hoechs 33258 染色液染核5 min，90%甘油封片并用錫紙包裹于4℃下保存，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同RABV 毒株在不同細胞上的效價

在進行免疫熒光前，為準確計算細胞接毒量，利用TCID50法測定CVS-11、SRV-9、PB4 毒株在N2A、BHK 細胞上的效價。結(jié)果顯示，CVS-11、SRV-9、PB4 毒株的效價有明顯差別，感染48 h 后CVS-11 的效價相對較高，SRV-9 的效價相對較低，PB4 是一種直接從感染小鼠腦中分離得到的街毒株，只感染N2A 細胞，感染72 h 后其效價依然很低（表1）。

表1 不同RABV 毒株在不同細胞上的效價Table 1 Titers of different RABV strains on different cells

2.2 不同RABV 毒株M 蛋白在不同細胞上與ER、Golgi 的共定位

2.2.1 不同RABV 毒株M 蛋白在N2A 細胞上與ER、Golgi 的共定位 為探究N2A 細胞中ER、Golgi 在RABV M 蛋白合成加工過程中的作用，結(jié)合不同RABV 株的感染特性，CVS-11、SRV-9于24 h 后進行免疫熒光，PB4 于72 h 后進行免疫熒光。通過激光共聚焦觀察顯示，在N2A 細胞中CVS-11、SRV-9、PB4 的M 蛋白與CNX、PDI 存在共定位，且共定位主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)（圖1、圖2）；與ERGIC-53 也存在共定位，且共定位也主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)（圖3），說明在N2A 細胞中CVS-11、SRV-9、PB4 的M 蛋白是通過ERGolgi 途徑合成加工；不同的是CVS-11、SRV-9的M 蛋白在胞膜附近有大量表達，而PB4 的M蛋白在胞膜附近幾乎無表達，說明CVS-11、SRV-9 的M 蛋白在24 h 后已到達細胞膜，而PB4的M蛋白即使在72 h后也很少出現(xiàn)在細胞膜附近。

圖1 N2A 細胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）、PB4（C）M 蛋白與ER 標志蛋白CNX 的共定位Fig.1 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）, SRV-9（B）,PB4（C）with ER marker protein CNX in N2A cells

圖2 N2A 細胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）、PB4（C）M 蛋白與ER 標志蛋白PDI 的共定位Fig.2 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）, SRV-9（B）,PB4（C）with ER marker protein PDI in N2A cells

2.2.2 不同RABV 毒株M 蛋白在BHK 細胞上與ER、Golgi 的共定位 在N2A 細胞內(nèi)共定位的基礎(chǔ)上，進一步探究不同RABV 毒株M 蛋白在BHK 細胞中的共定位情況。通過激光共聚焦觀察顯示，在BHK 細胞中CVS-11、SRV-9 的M 蛋白與CNX、PDI 存在共定位，且共定位主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)（圖4、圖5）；與ERGIC-53 也存在共定位，且共定位也主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)（圖6）；而且M蛋白在胞膜附近都有表達。這說明在BHK 細胞中CVS-11、SRV-9 的M 蛋白是通過ER-Golgi 途徑合成加工，且CVS-11、SRV-9 的M 蛋白在24 h后都已到達細胞膜附近。

2.3 RABV 的M 蛋白與G 蛋白以及ER、Golgi的共定位（以CVS-11 感染N2A 細胞為例）

由前述結(jié)果可知，3 種RABV 毒株的M 蛋白通過ER-Golgi 途徑合成加工，G 蛋白與M 蛋白在細胞內(nèi)共定位，有利于解析RABV 部分結(jié)構(gòu)蛋白的加工及組裝。在N2A 細胞中以MOI=1的病毒量接種CVS-11，24 h 后進行免疫熒光。通過激光共聚焦觀察顯示，CVS-11 的M 蛋白、G 蛋白與ER、Golgi 三者存在共定位（圖7），且三者共定位主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，在膜附近M蛋白與G 蛋白出現(xiàn)共定位，說明CVS-11 的G蛋白也可能通過ER-Golgi 途徑合成加工，可能在Golgi 內(nèi)M 蛋白與G 蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)運到細胞膜附近。

2.4 RABV 的M 蛋白與N 蛋白以及ER、Golgi的共定位（以SRV-9 感染BHK 細胞為例）

已有研究表明，N 蛋白以RNP 形式與G 蛋白和M 蛋白組裝成完整的RABV 粒子。在前述結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過研究M 蛋白和N 蛋白的共定位，探究M 蛋白與RNP 的結(jié)合先后順序。通過激光共聚焦顯示，在BHK 細胞中，SRV-9 的M 蛋白與ER、Golgi 有明顯共定位，這與前述結(jié)果相符，而N 蛋白與ER、Golgi 無明顯共定位；M 蛋白與N 蛋白的共定位主要在胞漿內(nèi)，且多出現(xiàn)在細胞膜附近（圖8 箭頭所示），提示病毒粒子可能處于出芽階段，同時也說明M 蛋白與RNP 結(jié)合發(fā)生于細胞膜附近。

圖3 N2A 細胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）、PB4（C）M 蛋白與Golgi 標志蛋白ERGIC-53 的共定位Fig.3 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）, SRV-9（B）,PB4（C）with Golgi marker protein ERGIC-53 in N2A cells

圖4 BHK 細胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）M 蛋白與ER 標志蛋白CNX 的共定位Fig.4 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）,SRV-9（B）with ER marker protein CNX in BHK cells

圖5 BHK 細胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）M 蛋白與ER 標志蛋白PDI 的共定位Fig.5 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）,SRV-9（B）with ER marker protein PDI in BHK cells

圖6 BHK 細胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）M 蛋白與Golgi 標志蛋白ERGIC-53 的共定位Fig.6 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）,SRV-9（B）with Golgi marker protein ERGIC-53 in BHK cells

圖7 N2A 細胞中CVS-11 的M 蛋白、G 蛋白與ER、Golgi 的共定位Fig.7 Co-localization of M proteins and G proteins from CVS-11 with ER or Golgi in N2A cells

3 討論

狂犬病是由RABV 感染引起的一種以神經(jīng)系統(tǒng)障礙為特征的高度致死性人畜共患傳染病［12］。M 蛋白是RABV 5 個結(jié)構(gòu)蛋白中氨基酸數(shù)量最小但變異卻最大的蛋白，在結(jié)構(gòu)蛋白的合成和裝配過程中起調(diào)控作用。ER 是真核細胞中最大的細胞器之一，呈扁平囊狀或小管狀。研究發(fā)現(xiàn)，許多分泌蛋白和膜蛋白都是由ER 合成；此外，ER還參與多種蛋白質(zhì)折疊、脂類和膽固醇合成等許多過程［13］。病毒在感染細胞的過程中也會利用ER 使其成為病毒與宿主細胞相互作用的核心［14］。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）表面附著大量核糖體，是胞內(nèi)多種蛋白的合成主要場所。Golgi 是細胞內(nèi)的中央膜結(jié)合細胞器，常位于細胞核附近，作為分泌通路的中心樞紐，接收來自ER 的蛋白質(zhì)并進行加工修飾后，將它們輸出到其他內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，如內(nèi)體、溶酶體、質(zhì)膜和細胞外，以發(fā)揮各自功能［15］。Golgi 還可以作為許多病毒的膜支架，或者被病毒用作病毒工廠進行病毒復(fù)制［16］。ER-Golgi 途徑是細胞中許多蛋白質(zhì)的合成加工場所，然后被轉(zhuǎn)運到達各自工作位點。研究發(fā)現(xiàn)，多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白都由ER-Golgi 途徑合成加工，例如，冠狀病毒（CoV）結(jié)構(gòu)蛋白M、S 和E 在ER 被合成，被折疊并包裝進入COP Ⅱ形成的囊泡中，然后從特定的ER 出口位點出芽，隨后到達Golgi 被糖基化修飾［17,18］。丙型肝炎病毒（HCV）包膜糖蛋白在ER 中與載脂蛋白相互作用，形成HCV LVPs后以COP Ⅱ囊泡的形式運輸?shù)紾olgi，通過Golgi分泌途徑最終出口［19］。水泡性口炎病毒（VSV）的糖蛋白G 也是通過ER-Golgi 途徑合成［20］。M蛋白作為RABV 結(jié)構(gòu)蛋白之一，在RABV 組裝過程中將RNP 與囊膜糖蛋白G 的C 端連接起來，是形成完整病毒粒子的關(guān)鍵，并決定了病毒粒子的毒力及下一級神經(jīng)元的感染。關(guān)于RABV 的M蛋白合成加工途徑的研究較少，我們猜測該蛋白也是通過ER-Golgi 途徑合成加工。RABV 在細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，合成所有結(jié)構(gòu)蛋白后便開始組裝新的病毒粒子，其基因組與N 蛋白、P 蛋白及L 蛋白共同形成RNP，但對于G 蛋白、M 蛋白及RNP 三者結(jié)合的先后順序還尚不清楚，它們?nèi)绾谓M裝成完整的RABV 粒子還需進一步探究。為此，本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡，發(fā)現(xiàn)在N2A、BHK 細胞中，3 種RABV 毒株（CVS-11、SRV-9、PB4）的M 蛋白均與ER、Golgi 存在共定位，同時也發(fā)現(xiàn)RABV 的M 蛋白與G 蛋白在ER、Golgi 上共定位，而M 蛋白與N蛋白則在胞漿中共定位，說明在體外傳代細胞中，RABV 的M 蛋白是通過ER-Golgi 途徑合成加工，且不同毒株在不同細胞系中的結(jié)果具有一致性。此外，在病毒粒子組裝過程中M 蛋白有可能先與G 蛋白結(jié)合，隨后與N 蛋白、P 蛋白和L 蛋白及RNA 形成的RNP 結(jié)合并出芽。本研究結(jié)果主要在體外傳代細胞中完成，關(guān)于RABV 的M 蛋白在體內(nèi)是否也存在同樣的合成加工途徑以及病毒粒子是否有同樣的裝配過程還有待進一步探索，而RABV 的M 蛋白在ER-Golgi 途徑中的合成修飾過程仍未知，同時核衣殼RNP 的位置、數(shù)量及顆粒大小也是RABV 復(fù)制能力的體現(xiàn)，不同毒株間是否存在差異也將是后期研究的重點。

4 結(jié)論

M 蛋白作為RABV 結(jié)構(gòu)蛋白之一，無論是在病毒的前期轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程還是后期裝配出芽過程都具有重要作用，因此對M 蛋白合成和分布場所的研究非常重要。本研究初步探究了不同RABV毒株M 蛋白在胞內(nèi)的合成和分布，發(fā)現(xiàn)RABV M蛋白在細胞內(nèi)主要通過ER-Golgi 途徑合成，并與G 蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運到細胞膜附近，隨后與RNP 結(jié)合，且不同RABV 毒株在不同細胞系中沒有明顯差異。