方法狀 陸曉瓏 方建明 陳獻(xiàn)琦 劉艷省 張家敏

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病隱匿，侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，惡性程度高等特點(diǎn)[1]。早期常無(wú)特異癥狀，就診時(shí)大多較晚，手術(shù)切除率低、生存期短、治愈率低，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的健康和生命安全。早期診斷和早期治療對(duì)于HCC 患者十分重要，尤其是對(duì)改善患者預(yù)后意義重大[2]。雖然早發(fā)現(xiàn)、早診斷能提高肝癌患者生存率，但目前的影像學(xué)檢查和病理檢查準(zhǔn)確性和敏感性存在一定程度的不足，而普通的血清腫瘤標(biāo)志物診斷效果較差，因此，如何高效準(zhǔn)確篩查早期肝癌患者，并評(píng)估患者預(yù)后和治療方案選擇是當(dāng)前醫(yī)學(xué)的重要課題[3]。監(jiān)測(cè)肝癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC），可以有效輔助診斷腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、評(píng)估預(yù)后和選擇治療方案。本研究擬采用CytoSorterCTC 檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)HCC 患者外周血CTC 進(jìn)行檢測(cè)，探索間質(zhì)表型循環(huán)腫瘤細(xì)胞（mesenchymal circulating tumor cell，MCTC）用于肝癌患者輔助診斷的臨床意義和診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2019 年3 月—2020 年9 月期間浙江金華廣福醫(yī)院收治的48 例疑似肝癌患者，經(jīng)病理學(xué)檢查確診35 例HCC、13 例良性肝病，其中男43例，女5 例；年齡20～72 歲，平均年齡57.8 歲。按照中國(guó)肝癌分期方案（China liver cancer staging，CNLC）[4]，確診肝癌患者包括Ⅰa-Ⅰb 期7 例，Ⅱa-Ⅱb 期5 例，Ⅲa 期6 例，Ⅲb 期17 例。確診肝癌患者中肝炎疾病患者15 例，非肝炎疾病患者20 例。同時(shí)選取在我院檢查的13 名健康體檢者作為陰性對(duì)照。本次研究由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（倫理批件號(hào)：ZJJHGFYY-2020-002）?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?/p>

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）未經(jīng)治療的疑似肝癌患者；（2）患者無(wú)手術(shù)、介入治療、放療、靶向治療等禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）智力或精神障礙；（2）無(wú)法配合此次臨床研究。

1.3 研究方法 所有入組確診肝癌患者分別在治療前2 天與治療后7～10 天，經(jīng)肘靜脈采集外周血樣本8～10mL，取出初始2mL 外周血，貯存于含有EDTA抗凝劑的真空采血管內(nèi)，將標(biāo)本室溫放置，24h 內(nèi)寄往杭州華得森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行MCTC 富集檢測(cè)。分析治療前和治療后MCTC 計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果。治療后通過(guò)電話、郵件、復(fù)查等方式隨訪，觀察治療后生存與復(fù)發(fā)情況，并分析治療后MCTC 檢測(cè)結(jié)果與治療效果、生存期和復(fù)發(fā)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，MCTC 數(shù)量與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者M(jìn)CTC 檢測(cè)結(jié)果 采用CytoSorter微流控芯片循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合CSV 捕獲抗體，可以高效富集檢測(cè)肝癌患者的外周血MCTC，如圖1 所示。MCTC 是被鑒定為CSV（FITC，綠色）陽(yáng)性、Hoechst（藍(lán)色）陽(yáng)性、CD45（PE，橙色）陰性的細(xì)胞。黃色箭頭表示的細(xì)胞即為MCTC。

圖1 肝癌CTC 免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果（比例尺代表10μm，×20）

圖2 肝癌、肝部良性疾病和健康人群外周血MCTC 檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 肝癌治療前后MCTC 水平與臨床病理特征相關(guān)性分析 對(duì)初始行手術(shù)、介入、放療、靶向等治療的肝癌患者，治療前后分別進(jìn)行外周血MCTC 檢測(cè)，將治療前后MCTC 數(shù)量分別與患者性別、年齡、CNLC分期、HbsAg 狀態(tài)、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、甲胎蛋白（AFP）水平進(jìn)行相關(guān)性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療前MCTC 水平與患者性別、年齡、腫瘤直徑無(wú)顯著相關(guān)性，但與患者AFP 水平（P=0.010）、HbsAg 狀態(tài)（P=0.003）、腫瘤數(shù)量（P=0.0150）、CNLC 分期（P=0.035）、血管侵犯（P=0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）和腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移（P=0.000）具有顯著相關(guān)性；治療后7～10 天MCTC 水平與患者性別、年齡、CNLC分期、血管侵犯無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），但與患者AFP 水平（P=0.037）、HbsAg 狀態(tài)（P=0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.019）和腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移（P=0.001）具有顯著相關(guān)性。治療前轉(zhuǎn)移性肝癌患者CTC 檢測(cè)率為100%（15/15），MCTC 檢出數(shù)量范圍1～37 個(gè)/5mL，平均MCTC 檢出數(shù)量5.9 個(gè)/5mL，中位MCTC 檢出數(shù)量為9 個(gè)/5mL；治療后轉(zhuǎn)移性肝癌患者M(jìn)CTC 檢測(cè)率為80%（12/15），MCTC 檢出數(shù)量范圍0～19 個(gè)/5mL，平均MCTC 檢出數(shù)量2.4 個(gè)/5mL，中位MCTC檢出數(shù)量為3 個(gè)/5mL；MCTC 可能更好反映肝癌腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移狀態(tài)。見(jiàn)表1。

表1 35 例肝癌患者治療前后MCTC 水平與臨床病理特征相關(guān)性分析

2.3 MCTC 與AFP 輔助肝癌臨床診斷分析 分別使用MCTC、AFP 和MCTC 聯(lián)合AFP 對(duì)初診肝癌患者進(jìn)行受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析（見(jiàn)圖3），結(jié)果顯示，單獨(dú)使用MCTC 作為診斷指標(biāo)，cutoff 設(shè)定為1 時(shí)，可以很好地區(qū)分肝癌患者和非肝癌患者，敏感性和特異性最佳，AUC=0.8815，P<0.0001。單獨(dú)使用AFP，AUC=0.6735，P=0.01993。MCTC 聯(lián)合AFP 檢測(cè)，AUC=0.8524，P<0.0001。MCTC 相對(duì)于AFP 可以更好的用于肝癌初診患者的鑒別診斷。

圖3 MCTC 與AFP 及其聯(lián)合檢測(cè)輔助肝癌診斷ROC 曲線

2.4 肝癌患者治療前后MCTC 數(shù)量及其變化 35例肝癌患者治療前，治療后7～10 天均進(jìn)行了MCTC檢測(cè)。治療前MCTC 數(shù)量與治療后MCTC 數(shù)量存在顯著差異（P＜0.001），治療后MCTC 數(shù)量減少，臨床療效評(píng)估結(jié)果顯示大部分患者疾病得到緩解。見(jiàn)圖4-5。

圖4 治療前后肝癌患者M(jìn)CTC 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

3 討論

CTC 臨床應(yīng)用的瓶頸在于其富集技術(shù)，CellSearch 系統(tǒng)是唯一通過(guò)美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于臨床CTC 檢測(cè)的方法，其基本原理是基于上皮細(xì)胞黏附因子（Epithelial cells adhesion molecule，EpCAM）抗體捕獲上皮表型CTC，該方法對(duì)肝癌CTC 檢測(cè)在臨床應(yīng)用具有極大的局限性，其靈敏度較低（約20%～40%）[5]。Kelley 等[6]采用CellSearch 系統(tǒng)對(duì)肝癌外周血CTC 進(jìn)行檢測(cè)，但結(jié)果顯示檢出率僅為30.5%。雖然肝癌細(xì)胞同樣屬于上皮性細(xì)胞，但EpCAM 僅在約35%的肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)。有研究表明，從腫瘤原發(fā)灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)的CTC 會(huì)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT），轉(zhuǎn)變成間質(zhì)型細(xì)胞的CTC 失去了EpCAM 抗原，同時(shí)，MCTC擁有類似干細(xì)胞的特性，具有更強(qiáng)的侵襲性和遷移能力，這是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因[7]。Satelli 等[8]驗(yàn)證了細(xì)胞表面波形蛋白（cell surface vimentin，CSV）抗體能夠有效的捕獲外周血MCTC，相比于CellSearch 系統(tǒng)的EpCAM 抗體，其對(duì)MCTC 具有更高的敏感性和特異性。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究證實(shí)，基于CSV 抗體的MCTC 檢測(cè)對(duì)于肝癌預(yù)后評(píng)估具有更好的輔助指導(dǎo)價(jià)值[9]。本研究采用CytoSorter微流控納米芯片CTC 檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合CSV 捕獲抗體，特異性富集初診肝癌患者外周血MCTC，結(jié)果顯示其敏感性為82.86%（29/35），相較與以往的富集技術(shù)對(duì)肝癌CTC檢出，CytoSorterCTC 檢測(cè)系統(tǒng)具有檢出效率更佳。

圖5 治療前后肝癌患者M(jìn)CTC 檢測(cè)結(jié)果變化趨勢(shì)

馮錦城等[10]通過(guò)采用CTC 和AFP 診斷肝癌患者，認(rèn)為CTC 對(duì)肝癌的診斷效能要優(yōu)于AFP，且肝癌患者血液CTC 水平明顯高于良性肝病患者。本研究結(jié)果顯示，肝癌患者外周血CTC 數(shù)量顯著高于健康體檢者和良性肝病患者（P＜0.01），這對(duì)于肝癌患者的輔助診斷和早期篩查預(yù)警具有重要的意義。

血行轉(zhuǎn)移是肝細(xì)胞肝癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式。Jin等[11]研究了肝細(xì)胞癌患者術(shù)前和術(shù)后外周血CTC 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)術(shù)前CTC 表達(dá)陽(yáng)性，術(shù)后復(fù)查多數(shù)會(huì)發(fā)生肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移，且CTC 表達(dá)陽(yáng)性，認(rèn)為CTC陽(yáng)性可以作為肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子。本研究通過(guò)對(duì)是否發(fā)生肝癌轉(zhuǎn)移的HCC 患者M(jìn)CTC 檢出個(gè)數(shù)的比較，發(fā)現(xiàn)肝癌轉(zhuǎn)移HCC 患者M(jìn)CTC 檢出率和檢出數(shù)量明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的HCC 患者，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0001），表明不同階段的肝癌患者外周血MCTC 數(shù)量不同，且隨著癌癥的惡化而逐漸增多，提示監(jiān)測(cè)肝癌患者M(jìn)CTC 能夠判斷患者疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移情況。

我們對(duì)35 例HCC 患者外周血MCTC 進(jìn)行了隨訪研究，不同患者的MCTC 變化程度不同，整體呈現(xiàn)下降減少趨勢(shì)，治療前MCTC 數(shù)量與治療后MCTC數(shù)量存在顯著差異（P＜0.001），治療后MCTC 數(shù)量普遍下降減少，臨床療效評(píng)估結(jié)果顯示大部分患者疾病得到緩解。這或許跟患者的治療情況、治療后護(hù)理、用藥指導(dǎo)等有關(guān)。治療前基線MCTC 水平可以預(yù)測(cè)肝癌患者復(fù)發(fā)狀況，MCTC≥1 的患者比MCTC＜1的肝癌患者更容易復(fù)發(fā)（P=0.0132），腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間更短?；颊進(jìn)CTC 數(shù)量的變化有助于實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝癌患者疾病進(jìn)展，這或許可以為肝癌患者的療效評(píng)估和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)提供臨床指導(dǎo)。

綜合所述，本研究初步證實(shí)采用的CSV 抗體微流控納米芯片的MCTC 富集檢測(cè)技術(shù)在肝癌患者輔助診斷中具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。肝癌患者外周血MCTC 檢測(cè)有助于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者的疾病發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。MCTC 檢測(cè)為肝癌患者的早發(fā)現(xiàn)早治療以及療效監(jiān)測(cè)提供了一定指導(dǎo)價(jià)值。本次研究尚存在樣本量偏小的不足，且隨訪時(shí)間較短，為更好地探索MCTC 檢測(cè)在肝癌患者中的應(yīng)用價(jià)值，需要進(jìn)一步放大樣本量研究，同時(shí)延長(zhǎng)隨訪時(shí)間。