莫霏霏 周晶晶 金玲玲 余 光

潰瘍性結腸炎是一種結腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，病變局限于大腸黏膜及黏膜下層，臨床癥狀表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、便秘、腹脹[1-2]。潰瘍性結腸炎與促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-6（IL-6）等失衡有關[3-4]。傳統(tǒng)藥物，如5-氨基水楊酸鹽（5-ASA）、皮質(zhì)類固醇、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤用于治療潰瘍性結腸炎，然而其潛在的副作用和有限的療效限制了這些藥物的臨床應用[5]。梔子苷是從茜草科植物梔子的干燥成熟果實中運用高科技生產(chǎn)工藝提取精制而成的產(chǎn)品，為環(huán)烯醚萜苷類化合物[6-7]。梔子苷廣泛用于治療多種疾病，具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)作用、抗凋亡、和神經(jīng)保護作用[8]。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）/肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）是炎癥調(diào)節(jié)通路，MLCK 磷酸化易位至細胞核，與DNA 結合并激活多種重要的炎癥靶基因，如白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、白細胞介素-12（IL-12）、TNF-α、一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）[9]。本研究擬探討梔子苷對潰瘍性結腸炎模型大鼠的抗炎作用及AMPK/MLCK 信號通路的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物體質(zhì)量180～220g 的Sprague-Dawley（SD）大鼠90 只購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，8～10 周齡，雌雄各半，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黔）2018-0003，動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0021，動物質(zhì)量合格證號GK304957。環(huán)境溫度（22±2）℃，保持12:12h 光-暗循環(huán)，自由進食飲水，大鼠適應性飼養(yǎng)1 周。本研究經(jīng)浙江省臺州市立醫(yī)院倫理委員會審核批準（倫理審批號：2020041701）。

1.2 藥品與試劑 梔子苷（原料藥，純度98%，西安青芷生物技術有限公司，批號QS006756）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（南京信帆生物技術有限公司，批號P2297）；柳氮磺胺吡啶（上海福達制藥有限公司，規(guī)格：0.25g/片，批號20190624）；TRIzol 試劑、SuperScriptⅢ逆轉錄酶（美國Invitrogen 公司，批號15596018、18080844）；熒光定量PCR 試劑盒（QuantiTect SYBR Green 試劑盒）（美國Qiagen 公司，批號218073）；PRO-PREP 蛋白質(zhì)提取緩沖液、PVDF 膜（碧云天生物技術研究所，批號SF0020-10、FFN05）；蛋白濃度測定試劑盒（美國Bio-Rad 公司，批號PF10552）；LaemmLi 樣品緩沖液（迪申生物技術上海有限公司，批號B1610737）；SDS-聚丙烯酰胺凝膠（美國賽默飛世爾公司，批號KG-60559）；AMPK、MLCK、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（艾美捷科技有限公司，批號A-ABV10093、A-ABV12699、D0063）；兔抗大鼠IgG 二抗（上海群己生物科技有限公司，批號PAB9434）；增強化學發(fā)光試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰?，批號KL-F253）；IL-2、IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司，批號214-838-02、214-838-06、K-024-09）。

1.3 儀器DM3000 型光學顯微鏡（德國徠卡公司）；CFX96 型實時熒光定量PCR 儀（美國BIO-RAD公司）；AlphaImager HP 型凝膠成像分析系統(tǒng)（自然基因北京科技有限公司）；MK3 型酶標儀（美國熱電公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模及給藥 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分成五組：對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組（300mg/kg）[10]、梔子苷低、高劑量組[11]（40、80mg/kg），每組18 只。模型組、柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組用TNBS 誘導潰瘍性結腸炎。具體操作如下：大鼠禁食過夜并用乙醚輕度麻醉，將5mg TNBS 溶于0.2mL 50%乙醇中，然后使用16 號灌洗針將混合溶液緩慢注入結腸中[12]。對照組大鼠僅用0.2mL 的50%乙醇處理。24h 后，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組給予相應藥物灌胃，灌胃體積10mL/kg，對照組及模型組給予等體積（10mL/kg）的生理鹽水，每天1 次，持續(xù)4 周。

2.2 各組大鼠結腸黏膜損傷指數(shù)、疾病活動指數(shù)（DAI）、大體形態(tài)損傷評分測定 試驗結束后，頸椎脫臼處死大鼠，鈍性分離結腸組織，測量長度和重量，4%多聚甲醛固定24h，石蠟包埋。制備結腸樣品，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下根據(jù)結腸形態(tài)學評估結腸病理損傷。結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI評分、大體形態(tài)損傷評分[13-14]：（1）結腸黏膜損傷指數(shù)：大潰瘍（≥3mm）計2 分，小潰瘍（＜3mm）計1 分，無潰瘍計0 分；重度炎癥計2 分，輕度炎癥計1 分，無炎癥計0 分。（2）DAI：其中大鼠體質(zhì)量下降≥15%、大便性狀稀便、肉眼血便計4 分；10%≤體質(zhì)量下降＜15%、大便性狀半稀便、隱血陽性計3 分；5%≤體質(zhì)量下降＜10%、大便性狀半稀便、隱血陽性計2分；；1%≤體質(zhì)量下降＜5%、大便性狀正常、隱血陰性計1 分；0≤體質(zhì)量下降＜1%、大便性狀正常、隱血陰性計0 分。（3）大體形態(tài)損傷評分：病變深達漿膜層計3 分，累及黏膜肌層計2 分，累及黏膜下層計1分，局限于黏膜層以上計0 分。

2.3 各組大鼠結腸組織AMPK、MLCK mRNA 水平測定 使用TRIzol 試劑從結腸組織分離總RNA，使用SuperScript Ⅲ逆轉錄酶進行逆轉錄。實時聚合酶鏈反應（PCR）測定結腸組織中AMPK、MLCK mRNA水平。用于PCR 分析的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：AMPK 正向5'-AAGGTGTCTAGCCTGGAGACCTGGTGATC-3' 和反向5'-CCTGTGACGTGAATCCCTGACTTGAGTGC-3'；MLCK 正向5'-CCTGACGTCTGGAGATCGAGGT-3'和反向 5' -CCTGTGACTATCAAATTGCGGT -3'；GAPDH 正向5'-ACAAGATGGTGAAGGTCGGTGTGA-3' 和反向5'-AGCTTCCCATTCTCAGCCTTGACT-3'。GAPDH 為內(nèi)參基因。使用QuantiTect SYBR Green 試劑盒在CFX96 型實時熒光定量PCR 儀中進行PCR，總反應體積為20μL。反應條件：在95℃下初始變性步驟10min，在95℃下變性15s，在57℃下退火20s，在72℃下延伸1min，進行40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT 法計算AMPK、MLCK mRNA 的相對表達量。

2.4 各組大鼠結腸組織AMPK、MLCK 蛋白水平測定 在PRO-PREP 蛋白質(zhì)提取緩沖液中裂解制備結腸組織提取物，用蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)與LaemmLi 樣品緩沖液混合并在加載前在100℃下加熱5min?？偟鞍踪|(zhì)樣品（30μg）在100～120V 下進行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳90min，分離的蛋白質(zhì)在100V 電泳轉移至PVDF 膜，在5%脫脂牛奶中室溫下封閉1h，然后以1:1000 的稀釋度與AMPK、MLCK、GAPDH 一抗孵育過夜。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中洗滌，室溫下加入兔抗大鼠IgG 二抗（1:2000 稀釋）孵育1h。采用增強化學發(fā)光試劑盒檢測表達強度。通過AlphaImager 軟件測量和分析蛋白質(zhì)印跡上每個條帶的相對強度，從光密度測量值中減去膠片中的背景，重復實驗3 遍，對獲得的相對強度值進行統(tǒng)計分析，圖中顯示的凝膠代表3個獨立實驗的結果。

2.5 各組大鼠結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平測定 獲取病變結腸組織，眼科剪剪碎，加生理鹽水勻漿，以7000r/min 離心15min，分離上清，置于4℃保存待測；使用ELISA 試劑盒測定大鼠結腸組織中IL-2、IL-6、TNF-α 水平，具體操作方法參照試劑盒說明書。

2.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行錄入、統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q 檢驗；P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分比較 與對照組比較，模型組結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分升高（P<0.05）；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分降低（P<0.05），且梔子苷高劑量組結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分低于梔子苷低劑量組（P<0.05）；與柳氮磺胺吡啶組比較，梔子苷低劑量組結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分升高（P<0.05），梔子苷高劑量組結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分無明顯變化（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分比較（分，）

表1 各組大鼠結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分比較（分，）

注：對照組和模型組予10mL/kg 生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；梔子苷低劑量組予40mg/kg 梔子苷灌胃；梔子苷高劑量組予80mg/kg 梔子苷灌胃；DAI 為疾病活動指數(shù)；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較，cP<0.05；與梔子苷低劑量組比較，dP<0.05

3.2 各組大鼠結腸組織病理結構比較 對照組結腸組織中未觀察到損傷，結腸結構正常；模型組腸黏膜充血，腸黏膜上皮細胞脫落，顯示炎性細胞浸潤到黏膜，杯狀細胞和上皮的脫落，隱窩結構變形，可見明顯中性粒細胞浸潤；柳氮磺胺吡啶組及梔子苷高劑量組結腸結構趨于正常，腸黏膜充血、腸黏膜上皮細胞脫落減輕，炎癥細胞浸潤減少，顯示隱窩結構，杯狀細胞和上皮細胞逐漸恢復；梔子苷低劑量組較模型組結腸結構好轉，但仍可見明顯充血及炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理結構圖（蘇木精-伊紅染色×200）

3.3 各組大鼠結腸組織AMPK、MLCK mRNA 表達水平比較 與對照組比較，模型組結腸組織AMPK mRNA 表達水平降低（P<0.05），MLCK mRNA 表達水平升高（P<0.05）；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結腸組織AMPK mRNA 表達水平升高（P<0.05），MLCK mRNA 表達水平降低（P<0.05），且梔子苷高劑量組結腸組織AMPK mRNA 表達水平高于梔子苷低劑量組（P<0.05），MLCK mRNA 表達水平低于梔子苷低劑量組（P<0.05）；與柳氮磺胺吡啶組比較，梔子苷低劑量組結腸組織AMPK mRNA 表達水平降低（P<0.05），MLCK mRNA表達水平升高（P<0.05），梔子苷高劑量組結腸組織AMPK、MLCK mRNA 表達水平無明顯變化（P>0.05）。見表2。

表2 各組大鼠結腸組織AMPK、MLCK mRNA 表達水平比較（）

表2 各組大鼠結腸組織AMPK、MLCK mRNA 表達水平比較（）

注：對照組和模型組予10mL/kg 的生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；梔子苷低劑量組予40mg/kg 梔子苷灌胃；梔子苷高劑量組予80mg/kg 梔子苷灌胃；AMPK 為腺苷酸激活蛋白激酶；MLCK 為肌球蛋白輕鏈激酶；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較，cP<0.05；與梔子苷低劑量組比較，dP<0.05

3.4 各組大鼠結腸組織AMPK、MLCK 蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組結腸組織AMPK 蛋白表達水平降低（P<0.05），MLCK 蛋白表達水平升高（P<0.05）；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結腸組織AMPK 蛋白表達水平升高（P<0.05），MLCK 蛋白表達水平降低（P<0.05），且梔子苷高劑量組結腸組織AMPK 蛋白表達水平高于梔子苷低劑量組（P<0.05），MLCK 蛋白表達水平低于梔子苷低劑量組（P<0.05）；與柳氮磺胺吡啶組比較，梔子苷低劑量組結腸組織AMPK 蛋白表達水平降低（P<0.05），MLCK 蛋白表達水平升高（P<0.05），梔子苷高劑量組結腸組織AMPK、MLCK 蛋白表達水平無明顯變化（P>0.05）。見表3、圖2。

表3 各組大鼠結腸組織AMPK、MLCK 蛋白表達水平比較（）

表3 各組大鼠結腸組織AMPK、MLCK 蛋白表達水平比較（）

注：對照組和模型組予10mL/kg 的生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；梔子苷低劑量組予40mg/kg 梔子苷灌胃；梔子苷高劑量組予80mg/kg 梔子苷灌胃；AMPK 為腺苷酸激活蛋白激酶；MLCK 為肌球蛋白輕鏈激酶；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較，cP<0.05；與梔子苷低劑量組比較，dP<0.05

圖2 各組大鼠結腸組織AMPK、MLCK 蛋白印跡圖

3.5 梔子苷對大鼠結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平的影響 與對照組比較，模型組結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平升高（P<0.05）；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平降低（P<0.05），且梔子苷高劑量組結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平低于梔子苷低劑量組（P<0.05）；與柳氮磺胺吡啶組比較，梔子苷低劑量組結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平升高（P<0.05），梔子苷高劑量組IL-2、IL-6、TNF-α 水平無明顯變化（P>0.05）。見表4。

表4 梔子苷對大鼠結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平的影響（ng/g，）

表4 梔子苷對大鼠結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平的影響（ng/g，）

注：對照組和模型組予10mL/kg 的生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；梔子苷低劑量組予40mg/kg 梔子苷灌胃；梔子苷高劑量組予80mg/kg 梔子苷灌胃；IL-2 為白細胞介素-2；IL-6 為白細胞介素-6；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較，cP<0.05；與梔子苷低劑量組比較，dP<0.05

4 討論

梔子苷來自傳統(tǒng)中藥梔子果實，具有止瀉、保肝、抗炎和抗內(nèi)毒素活性的作用[15-16]。據(jù)報道，梔子苷通過抑制炎癥反應和腎細胞凋亡治療急性腎損傷；通過抑制炎癥和改善細胞凋亡治療阿爾茨海默病；通過抑制核因子-κB 對動物心臟具有保護作用[17]。本研究旨在探討梔子苷在潰瘍性結腸炎模型大鼠腸道炎癥防護和改善中的作用及其機制。本次研究結果顯示，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分低于模型組，且梔子苷高劑量組結腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分低于梔子苷低劑量組（P<0.05）。黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分為腸道損傷的具體指標，其水平越高說明損傷越嚴重[18]；本研究結果表明，梔子苷能抑制潰瘍性結腸炎大鼠腸道損傷。結合病理結果，柳氮磺胺吡啶組及梔子苷高劑量組結腸結構趨于正常，腸黏膜充血、腸黏膜上皮細胞脫落減輕，炎癥細胞浸潤減少，顯示隱窩結構，杯狀細胞和上皮細胞逐漸恢復；梔子苷低劑量組較模型組結腸結構好轉，但仍可見明顯充血及炎癥細胞浸潤，這說明梔子苷明顯抑制潰瘍性結腸炎大鼠腸道炎癥反應。

腸上皮屏障功能的維持和破壞與腸道炎癥有關，AMPK 活性在上皮屏障功能中具有特定的作用[19]。脂多糖（LPS）誘導的腸道內(nèi)皮通透性過高與AMPK 活性降低同時發(fā)生，5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1呋喃半乳糖（一種有效的AMPK 激活劑）對AMPK的激活減弱了LPS 誘導的體外內(nèi)皮通透性[20]。增加的MLCK 蛋白表達和減少的閉鎖蛋白（occludin）/閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）表達被發(fā)現(xiàn)誘導腸屏障功能的破壞[21]。炎癥是針對有害和感染因子的宿主防御反應的結果，涉及許多疾病的病理生理學[22]。炎性刺激通過IkBa 的降解磷酸化引起MLCK 信號傳導的激活，Phospho-MLCK 易位到細胞核中并與DNA 結合，從而作為不同促炎調(diào)節(jié)因子的轉錄因子，如IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α、iNOS 和COX-2[23]，因此，抑制MLCK 信號傳導將是減輕炎癥的治療方法之一[24]。本研究結果顯示，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低劑量組、梔子苷高劑量組結腸組織AMPK mRNA 和蛋白表達高于模型組，MLCK mRNA 和蛋白表達低于模型組，且梔子苷高劑量組結腸組織AMPK mRNA 和蛋白表達高于梔子苷低劑量組，MLCK mRNA 和蛋白表達低于梔子苷低劑量組。認為梔子苷增強AMPK mRNA 和蛋白表達，抑制MLCK mRNA 和蛋白表達。同時本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平高于對照組（P<0.05），柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平低于模型組，且梔子苷高劑量組結腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平低于梔子苷低劑量組（P<0.05），表明梔子苷可能通過AMPK/MLCK 通路抑制炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α 表達水平。

綜上所述，梔子苷能抑制潰瘍性結腸炎大鼠腸道損傷及炎癥反應；其機制可能與增強結腸組織AMPK mRNA 和蛋白表達，抑制MLCK mRNA 和蛋白表達，進而抑制AMPK/MLCK 信號通路有關。