莫霏霏 周晶晶 金玲玲 余 光

潰瘍性結(jié)腸炎是一種結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，病變局限于大腸黏膜及黏膜下層，臨床癥狀表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、便秘、腹脹[1-2]。潰瘍性結(jié)腸炎與促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等失衡有關(guān)[3-4]。傳統(tǒng)藥物，如5-氨基水楊酸鹽（5-ASA）、皮質(zhì)類固醇、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤用于治療潰瘍性結(jié)腸炎，然而其潛在的副作用和有限的療效限制了這些藥物的臨床應(yīng)用[5]。梔子苷是從茜草科植物梔子的干燥成熟果實(shí)中運(yùn)用高科技生產(chǎn)工藝提取精制而成的產(chǎn)品，為環(huán)烯醚萜苷類化合物[6-7]。梔子苷廣泛用于治療多種疾病，具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)作用、抗凋亡、和神經(jīng)保護(hù)作用[8]。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）/肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）是炎癥調(diào)節(jié)通路，MLCK 磷酸化易位至細(xì)胞核，與DNA 結(jié)合并激活多種重要的炎癥靶基因，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、白細(xì)胞介素-12（IL-12）、TNF-α、一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）[9]。本研究擬探討梔子苷對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的抗炎作用及AMPK/MLCK 信號通路的影響，報道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物體質(zhì)量180～220g 的Sprague-Dawley（SD）大鼠90 只購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，8～10 周齡，雌雄各半，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黔）2018-0003，動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0021，動物質(zhì)量合格證號GK304957。環(huán)境溫度（22±2）℃，保持12:12h 光-暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本研究經(jīng)浙江省臺州市立醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（倫理審批號：2020041701）。

1.2 藥品與試劑 梔子苷（原料藥，純度98%，西安青芷生物技術(shù)有限公司，批號QS006756）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（南京信帆生物技術(shù)有限公司，批號P2297）；柳氮磺胺吡啶（上海福達(dá)制藥有限公司，規(guī)格：0.25g/片，批號20190624）；TRIzol 試劑、SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Invitrogen 公司，批號15596018、18080844）；熒光定量PCR 試劑盒（QuantiTect SYBR Green 試劑盒）（美國Qiagen 公司，批號218073）；PRO-PREP 蛋白質(zhì)提取緩沖液、PVDF 膜（碧云天生物技術(shù)研究所，批號SF0020-10、FFN05）；蛋白濃度測定試劑盒（美國Bio-Rad 公司，批號PF10552）；LaemmLi 樣品緩沖液（迪申生物技術(shù)上海有限公司，批號B1610737）；SDS-聚丙烯酰胺凝膠（美國賽默飛世爾公司，批號KG-60559）；AMPK、MLCK、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（艾美捷科技有限公司，批號A-ABV10093、A-ABV12699、D0063）；兔抗大鼠IgG 二抗（上海群己生物科技有限公司，批號PAB9434）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆朘L-F253）；IL-2、IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司，批號214-838-02、214-838-06、K-024-09）。

1.3 儀器DM3000 型光學(xué)顯微鏡（德國徠卡公司）；CFX96 型實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國BIO-RAD公司）；AlphaImager HP 型凝膠成像分析系統(tǒng)（自然基因北京科技有限公司）；MK3 型酶標(biāo)儀（美國熱電公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組、造模及給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成五組：對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組（300mg/kg）[10]、梔子苷低、高劑量組[11]（40、80mg/kg），每組18 只。模型組、柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組用TNBS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎。具體操作如下：大鼠禁食過夜并用乙醚輕度麻醉，將5mg TNBS 溶于0.2mL 50%乙醇中，然后使用16 號灌洗針將混合溶液緩慢注入結(jié)腸中[12]。對照組大鼠僅用0.2mL 的50%乙醇處理。24h 后，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組給予相應(yīng)藥物灌胃，灌胃體積10mL/kg，對照組及模型組給予等體積（10mL/kg）的生理鹽水，每天1 次，持續(xù)4 周。

2.2 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、疾病活動指數(shù)（DAI）、大體形態(tài)損傷評分測定 試驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，鈍性分離結(jié)腸組織，測量長度和重量，4%多聚甲醛固定24h，石蠟包埋。制備結(jié)腸樣品，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下根據(jù)結(jié)腸形態(tài)學(xué)評估結(jié)腸病理損傷。結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI評分、大體形態(tài)損傷評分[13-14]：（1）結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)：大潰瘍（≥3mm）計2 分，小潰瘍（＜3mm）計1 分，無潰瘍計0 分；重度炎癥計2 分，輕度炎癥計1 分，無炎癥計0 分。（2）DAI：其中大鼠體質(zhì)量下降≥15%、大便性狀稀便、肉眼血便計4 分；10%≤體質(zhì)量下降＜15%、大便性狀半稀便、隱血陽性計3 分；5%≤體質(zhì)量下降＜10%、大便性狀半稀便、隱血陽性計2分；；1%≤體質(zhì)量下降＜5%、大便性狀正常、隱血陰性計1 分；0≤體質(zhì)量下降＜1%、大便性狀正常、隱血陰性計0 分。（3）大體形態(tài)損傷評分：病變深達(dá)漿膜層計3 分，累及黏膜肌層計2 分，累及黏膜下層計1分，局限于黏膜層以上計0 分。

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織AMPK、MLCK mRNA 水平測定 使用TRIzol 試劑從結(jié)腸組織分離總RNA，使用SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測定結(jié)腸組織中AMPK、MLCK mRNA水平。用于PCR 分析的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：AMPK 正向5'-AAGGTGTCTAGCCTGGAGACCTGGTGATC-3' 和反向5'-CCTGTGACGTGAATCCCTGACTTGAGTGC-3'；MLCK 正向5'-CCTGACGTCTGGAGATCGAGGT-3'和反向 5' -CCTGTGACTATCAAATTGCGGT -3'；GAPDH 正向5'-ACAAGATGGTGAAGGTCGGTGTGA-3' 和反向5'-AGCTTCCCATTCTCAGCCTTGACT-3'。GAPDH 為內(nèi)參基因。使用QuantiTect SYBR Green 試劑盒在CFX96 型實(shí)時熒光定量PCR 儀中進(jìn)行PCR，總反應(yīng)體積為20μL。反應(yīng)條件：在95℃下初始變性步驟10min，在95℃下變性15s，在57℃下退火20s，在72℃下延伸1min，進(jìn)行40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT 法計算AMPK、MLCK mRNA 的相對表達(dá)量。

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織AMPK、MLCK 蛋白水平測定 在PRO-PREP 蛋白質(zhì)提取緩沖液中裂解制備結(jié)腸組織提取物，用蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)與LaemmLi 樣品緩沖液混合并在加載前在100℃下加熱5min?？偟鞍踪|(zhì)樣品（30μg）在100～120V 下進(jìn)行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳90min，分離的蛋白質(zhì)在100V 電泳轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，在5%脫脂牛奶中室溫下封閉1h，然后以1:1000 的稀釋度與AMPK、MLCK、GAPDH 一抗孵育過夜。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中洗滌，室溫下加入兔抗大鼠IgG 二抗（1:2000 稀釋）孵育1h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測表達(dá)強(qiáng)度。通過AlphaImager 軟件測量和分析蛋白質(zhì)印跡上每個條帶的相對強(qiáng)度，從光密度測量值中減去膠片中的背景，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 遍，對獲得的相對強(qiáng)度值進(jìn)行統(tǒng)計分析，圖中顯示的凝膠代表3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平測定 獲取病變結(jié)腸組織，眼科剪剪碎，加生理鹽水勻漿，以7000r/min 離心15min，分離上清，置于4℃保存待測；使用ELISA 試劑盒測定大鼠結(jié)腸組織中IL-2、IL-6、TNF-α 水平，具體操作方法參照試劑盒說明書。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q 檢驗(yàn)；P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分比較 與對照組比較，模型組結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分升高（P<0.05）；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分降低（P<0.05），且梔子苷高劑量組結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分低于梔子苷低劑量組（P<0.05）；與柳氮磺胺吡啶組比較，梔子苷低劑量組結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分升高（P<0.05），梔子苷高劑量組結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分無明顯變化（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分比較（分，）

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分比較（分，）

注：對照組和模型組予10mL/kg 生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；梔子苷低劑量組予40mg/kg 梔子苷灌胃；梔子苷高劑量組予80mg/kg 梔子苷灌胃；DAI 為疾病活動指數(shù)；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較，cP<0.05；與梔子苷低劑量組比較，dP<0.05

3.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)比較 對照組結(jié)腸組織中未觀察到損傷，結(jié)腸結(jié)構(gòu)正常；模型組腸黏膜充血，腸黏膜上皮細(xì)胞脫落，顯示炎性細(xì)胞浸潤到黏膜，杯狀細(xì)胞和上皮的脫落，隱窩結(jié)構(gòu)變形，可見明顯中性粒細(xì)胞浸潤；柳氮磺胺吡啶組及梔子苷高劑量組結(jié)腸結(jié)構(gòu)趨于正常，腸黏膜充血、腸黏膜上皮細(xì)胞脫落減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，顯示隱窩結(jié)構(gòu)，杯狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞逐漸恢復(fù)；梔子苷低劑量組較模型組結(jié)腸結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，但仍可見明顯充血及炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)圖（蘇木精-伊紅染色×200）

3.3 各組大鼠結(jié)腸組織AMPK、MLCK mRNA 表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組結(jié)腸組織AMPK mRNA 表達(dá)水平降低（P<0.05），MLCK mRNA 表達(dá)水平升高（P<0.05）；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結(jié)腸組織AMPK mRNA 表達(dá)水平升高（P<0.05），MLCK mRNA 表達(dá)水平降低（P<0.05），且梔子苷高劑量組結(jié)腸組織AMPK mRNA 表達(dá)水平高于梔子苷低劑量組（P<0.05），MLCK mRNA 表達(dá)水平低于梔子苷低劑量組（P<0.05）；與柳氮磺胺吡啶組比較，梔子苷低劑量組結(jié)腸組織AMPK mRNA 表達(dá)水平降低（P<0.05），MLCK mRNA表達(dá)水平升高（P<0.05），梔子苷高劑量組結(jié)腸組織AMPK、MLCK mRNA 表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織AMPK、MLCK mRNA 表達(dá)水平比較（）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織AMPK、MLCK mRNA 表達(dá)水平比較（）

注：對照組和模型組予10mL/kg 的生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；梔子苷低劑量組予40mg/kg 梔子苷灌胃；梔子苷高劑量組予80mg/kg 梔子苷灌胃；AMPK 為腺苷酸激活蛋白激酶；MLCK 為肌球蛋白輕鏈激酶；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較，cP<0.05；與梔子苷低劑量組比較，dP<0.05

3.4 各組大鼠結(jié)腸組織AMPK、MLCK 蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組結(jié)腸組織AMPK 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），MLCK 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結(jié)腸組織AMPK 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），MLCK 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），且梔子苷高劑量組結(jié)腸組織AMPK 蛋白表達(dá)水平高于梔子苷低劑量組（P<0.05），MLCK 蛋白表達(dá)水平低于梔子苷低劑量組（P<0.05）；與柳氮磺胺吡啶組比較，梔子苷低劑量組結(jié)腸組織AMPK 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），MLCK 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），梔子苷高劑量組結(jié)腸組織AMPK、MLCK 蛋白表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）。見表3、圖2。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織AMPK、MLCK 蛋白表達(dá)水平比較（）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織AMPK、MLCK 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：對照組和模型組予10mL/kg 的生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；梔子苷低劑量組予40mg/kg 梔子苷灌胃；梔子苷高劑量組予80mg/kg 梔子苷灌胃；AMPK 為腺苷酸激活蛋白激酶；MLCK 為肌球蛋白輕鏈激酶；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較，cP<0.05；與梔子苷低劑量組比較，dP<0.05

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織AMPK、MLCK 蛋白印跡圖

3.5 梔子苷對大鼠結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平的影響 與對照組比較，模型組結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平升高（P<0.05）；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平降低（P<0.05），且梔子苷高劑量組結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平低于梔子苷低劑量組（P<0.05）；與柳氮磺胺吡啶組比較，梔子苷低劑量組結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平升高（P<0.05），梔子苷高劑量組IL-2、IL-6、TNF-α 水平無明顯變化（P>0.05）。見表4。

表4 梔子苷對大鼠結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平的影響（ng/g，）

表4 梔子苷對大鼠結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平的影響（ng/g，）

注：對照組和模型組予10mL/kg 的生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；梔子苷低劑量組予40mg/kg 梔子苷灌胃；梔子苷高劑量組予80mg/kg 梔子苷灌胃；IL-2 為白細(xì)胞介素-2；IL-6 為白細(xì)胞介素-6；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較，cP<0.05；與梔子苷低劑量組比較，dP<0.05

4 討論

梔子苷來自傳統(tǒng)中藥梔子果實(shí)，具有止瀉、保肝、抗炎和抗內(nèi)毒素活性的作用[15-16]。據(jù)報道，梔子苷通過抑制炎癥反應(yīng)和腎細(xì)胞凋亡治療急性腎損傷；通過抑制炎癥和改善細(xì)胞凋亡治療阿爾茨海默??；通過抑制核因子-κB 對動物心臟具有保護(hù)作用[17]。本研究旨在探討梔子苷在潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸道炎癥防護(hù)和改善中的作用及其機(jī)制。本次研究結(jié)果顯示，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分低于模型組，且梔子苷高劑量組結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分低于梔子苷低劑量組（P<0.05）。黏膜損傷指數(shù)、DAI 評分、大體形態(tài)損傷評分為腸道損傷的具體指標(biāo)，其水平越高說明損傷越嚴(yán)重[18]；本研究結(jié)果表明，梔子苷能抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道損傷。結(jié)合病理結(jié)果，柳氮磺胺吡啶組及梔子苷高劑量組結(jié)腸結(jié)構(gòu)趨于正常，腸黏膜充血、腸黏膜上皮細(xì)胞脫落減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，顯示隱窩結(jié)構(gòu)，杯狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞逐漸恢復(fù)；梔子苷低劑量組較模型組結(jié)腸結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，但仍可見明顯充血及炎癥細(xì)胞浸潤，這說明梔子苷明顯抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道炎癥反應(yīng)。

腸上皮屏障功能的維持和破壞與腸道炎癥有關(guān)，AMPK 活性在上皮屏障功能中具有特定的作用[19]。脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的腸道內(nèi)皮通透性過高與AMPK 活性降低同時發(fā)生，5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1呋喃半乳糖（一種有效的AMPK 激活劑）對AMPK的激活減弱了LPS 誘導(dǎo)的體外內(nèi)皮通透性[20]。增加的MLCK 蛋白表達(dá)和減少的閉鎖蛋白（occludin）/閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）表達(dá)被發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)腸屏障功能的破壞[21]。炎癥是針對有害和感染因子的宿主防御反應(yīng)的結(jié)果，涉及許多疾病的病理生理學(xué)[22]。炎性刺激通過IkBa 的降解磷酸化引起MLCK 信號傳導(dǎo)的激活，Phospho-MLCK 易位到細(xì)胞核中并與DNA 結(jié)合，從而作為不同促炎調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄因子，如IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α、iNOS 和COX-2[23]，因此，抑制MLCK 信號傳導(dǎo)將是減輕炎癥的治療方法之一[24]。本研究結(jié)果顯示，柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低劑量組、梔子苷高劑量組結(jié)腸組織AMPK mRNA 和蛋白表達(dá)高于模型組，MLCK mRNA 和蛋白表達(dá)低于模型組，且梔子苷高劑量組結(jié)腸組織AMPK mRNA 和蛋白表達(dá)高于梔子苷低劑量組，MLCK mRNA 和蛋白表達(dá)低于梔子苷低劑量組。認(rèn)為梔子苷增強(qiáng)AMPK mRNA 和蛋白表達(dá)，抑制MLCK mRNA 和蛋白表達(dá)。同時本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平高于對照組（P<0.05），柳氮磺胺吡啶組、梔子苷低、高劑量組結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平低于模型組，且梔子苷高劑量組結(jié)腸組織IL-2、IL-6、TNF-α 水平低于梔子苷低劑量組（P<0.05），表明梔子苷可能通過AMPK/MLCK 通路抑制炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α 表達(dá)水平。

綜上所述，梔子苷能抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道損傷及炎癥反應(yīng)；其機(jī)制可能與增強(qiáng)結(jié)腸組織AMPK mRNA 和蛋白表達(dá)，抑制MLCK mRNA 和蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制AMPK/MLCK 信號通路有關(guān)。